楊 洋,劉永娟,張華北

(放射性藥物教育部重點實驗室,北京師范大學 化學學院,北京 100875)

阿爾茨海默病(AD)是老年人最常見的腦神經(jīng)退化疾病,臨床特征包括記憶力減退、認知功能障礙和癡呆等[1]。AD的神經(jīng)病理學特征包括大腦神經(jīng)細胞外大量的老年斑(SPs)和神經(jīng)細胞內(nèi)大量的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)。腦中Aβ斑塊的形成是AD病理學的關(guān)鍵[2-4]。因此,利用PET和SPECT技術(shù)進行顯像測定Aβ沉積的位置和數(shù)量,可對阿爾茨海默病進行早期無創(chuàng)診斷[5,6]。

如今,用來直接對活體大腦內(nèi)Aβ斑塊進行特異性顯像的顯像劑的發(fā)展為AD的診斷提供了契機。這些研究主要集中于Aβ斑塊的特異性配體,近期報道的較成功的AD顯像劑有18FFDDNP[7,8]、11C-PIB[9,10]、11C-SB-13[11,12]和11CBF-207[13]。迄今為止,已經(jīng)報道了一系列新型的用于活體Aβ斑塊顯像的碘標記的黃酮和苯乙烯色酮衍生物,并且碘標記的黃酮類化合物有較高的腦攝取量并能快速從腦內(nèi)清除,有望成為探測Aβ斑塊的候選顯像劑。然而,用于Aβ特異性顯像的99Tcm標記的黃酮衍生物還沒有得到發(fā)展,目前還沒有用于人體AD評價的99Tcm標記顯像劑。相對于PET顯像劑,99Tcm標記的顯像劑制備更簡單、方便,是更適用的定量分析AD的SPECT顯像方法。

99Tcm(T1/2=6 h,140 keV,由99Mo-99Tcm發(fā)生器生產(chǎn))是診斷用放射性藥物中最常用的放射性核素[14],99Tcm發(fā)射的中等能量γ射線能被γ照相機探測,物理半衰期與動物分布和顯像所需要的滯留時間相匹配[15]。為了研制出99Tcm標記的Aβ特異性顯像劑,根據(jù)黃酮衍生物與本小組擬設(shè)計合成以99Tcm(CO)3+為中心的黃酮類Aβ(1-40)斑塊顯像劑,并根據(jù) Re和 Tc性質(zhì)十分相似這一特點[16,17],合成其相應的錸配合物Re(CO)3+-flavone,以證明99Tcm(CO)3+-flavone的結(jié)構(gòu),用熒光方法定量錸配合物與Aβ(1-40)斑塊的體外結(jié)合常數(shù),并進行99Tcm(CO)3+-flavone在正常小鼠體內(nèi)的生物分布實驗,研究99Tcm(CO)3+-黃酮類衍生物作為AD顯像劑的可能性。

1 主要實驗材料

1.1 試劑和儀器

99Mo-99Tcm發(fā)生器:北京新科斯達醫(yī)藥公司產(chǎn)品;[99Tcm(CO3(H 2O3]+:參照文獻[18]制備 ;Aβ(1～40)纖維:參照文獻[19]制備 ,并在制備后立即使用。所有藥品和試劑都是從市場上購買,直接使用而未進行再次處理。

反相高壓液相色譜(RPHPLC):配A lltech系統(tǒng)(HPLC泵模型626,LINEAR UVIS-201,BIOSCAN流度計),分析 C-18柱(4.6 mm×250mm,5μm,Venusil MP-C18,美國艾杰爾科技有限公司),采用1m L/min流速洗脫。

Bruker-400 NMR核磁共振儀:美國Varian公司產(chǎn)品;Trance MS2000質(zhì)譜儀:Finnigan公司提供;AVATAR 360傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片):美國 Nicolet公司提供;1470WizardTM自動γ計數(shù)器:美國Wallac公司;Fluorolog Tau-3熒光分光光度計:法國J-Y公司產(chǎn)品;Cintra 10e紫外分光光度計:澳大利亞GBC公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物

昆明小鼠:12只,18～20 g,SPF級,北京大學動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 Re(CO)3+-flavone(E)的合成

利用分子對接研究黃酮分子與Aβ(1～40)纖維(蛋白)相互作用以及黃酮分子本身的三維定量構(gòu)效關(guān)系(3D-QSAR),以設(shè)計全新的能夠用99Tcm核心標記的黃酮類衍生物。根據(jù)研究結(jié)果設(shè)計的Re(CO)3+-flavone合成路線示于圖1。2.1.1 羥乙基胺基二乙酸叔丁酯(A)的合成將44.5 g(228.2 mmol)溴乙酸叔丁酯和25.67 g(256.7 mm ol)KHCO3溶于150 m L DMF中,將體系溫度降到0℃,攪拌,緩慢滴加(40m in)6.2m L(102.9 mm ol)2-氨基乙醇;此后,水浴加熱,維持溫度在38～45℃,反應24 h,停止加熱和攪拌,使體系自然冷卻至室溫;向體系中加入飽和NaHCO3溶液調(diào)pH至7,然后加入乙醚萃取,分液,有機相再用飽和NaCl溶液洗3次(每次 100 m L),分液,有機相用飽和Na2 SO4干燥36 h,過濾,旋蒸除去乙醚。粗產(chǎn)品通過硅膠柱純化(流動相為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1),產(chǎn)品的R f為 0.45,得到的產(chǎn)品為白色晶體。

圖1 Re(CO)3+-flavone的合成路線

2.1.2 溴乙基胺基二乙酸叔丁酯(B)的合成將1.75 g A(6.0 mm ol),6.32 g(24.1 mmol)Ph3 P溶于30 m L CH 2 Cl2中,將體系溫度降至0℃,向體系中加入4.31 g(24.2 mm ol,溶于100 m L CH2 Cl2)NBS,1.5 h滴完,室溫下反應16 h。旋蒸除去溶劑CH 2 Cl2,用乙醚洗滌,旋蒸除去乙醚,得到白色固體。粗產(chǎn)品通過硅膠柱分離(流動相為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=8∶1),產(chǎn)品的R f值為0.7,得到無色油狀產(chǎn)品。

2.1.3 2-苯基-3-(二叔丁基二乙酸基胺基)乙氧基-4-氧代-苯并吡喃(C)的合成 50mg黃酮醇、10.5 mg KOH和B(65.5mg)溶于150m L乙醇溶劑中,在室溫下攪拌24 h。析出白色固體,過濾除去固體得到淡黃色溶液,旋蒸除去溶劑,用硅膠柱分離得到最終產(chǎn)品(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1,產(chǎn)品的Rf值為0.6)。最終產(chǎn)品為亮黃色固體。

2.1.4 2-苯基-3-(二羧基胺基)乙氧基-4-氧代-苯并吡喃(D)的合成 1 g C和2 g CF3 COOH溶解在 150 m L CH 2 Cl2中,室溫下攪拌4 d,停止反應,向體系中緩慢加入飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)體系的pH為7,分液,保留有機相,有機相多次用飽和NaHCO3溶液洗滌,分液,旋蒸除去溶劑,得到黃色油狀固體。

2.1.5 Re(CO)3+-flavone(E)的合成 取55m g化合物 D、55 m g Re(CO)5Br和 15 mg KOH溶于50m L乙醇溶劑中,在55℃下攪拌4 h,旋蒸除去溶劑,粗產(chǎn)物用乙醚洗滌得到橙紅色油狀物,用硅膠柱分離得到最終產(chǎn)品(V(CH2 Cl2)∶V(乙醇)=4∶1,產(chǎn)物的R f=0.9)。

2.2 99Tcm(CO)3+-flavone的制備

將0.5 m L(約10 GBq/L)[99Tcm(CO3(H 2O3]+溶液加入盤尼西林小瓶中,再加入0.1m L D的水溶液(D的質(zhì)量濃度為0.05 g/L)。調(diào)pH到8,100℃下加熱30 min。

2.3 標記產(chǎn)物的分析

2.3.1 HPLC分析 HPLC分析條件為:0～0.01 min,乙腈 0%,水100%;0.01～10.00 min,乙腈 100%,水 0%;10.01～ 15.00min,乙腈100%,水0%。流速1.0m L/min。

2.3.2 TLC分析 TLC用來定性分析反應產(chǎn)物99Tcm(CO)3+-flavone和[99Tcm(CO3(H2O3]+核心。分析條件為:聚酰胺紙(10 cm×0.5 cm)為固定相,生理鹽水為展開劑。用1470 WizardTM自動γ計數(shù)器測放射性計數(shù)。標記物的TLC分析結(jié)果顯示,99Tcm(CO)3+-flavone和[99Tcm(CO3(H 2O3]+的 R f分別為0.8～0.9和0～0.1。

2.4 溶液中Aβ纖維的結(jié)合實驗

2.4.1 Aβ(1-40)纖維的形成 Aβ(1-40)纖維按照文獻[19]方法制備:將1m g Aβ(1-40)單體溶于2m L PBS(pH=7.4)溶液中,得到0.5 g/L的Aβ溶液,向溶液中加入EDTA(1 mm ol/L)后將上述溶液置于恒溫搖床內(nèi),在37℃下,350 r/min,搖動72 h。得到微濁的、有白色絮狀懸濁液。借助熒光光譜用硫磺素 T證明Aβ(1-40)纖維的形成[20]。Aβ(1-40)纖維在制備后立即使用。

2.4.2 熒光方法研究Re(CO)3+-flavone與Aβ纖維的結(jié)合能力 用500μL PBS溶液(pH=7.4)稀釋新鮮的Re(CO)3+-flavone溶液至4～9 nmo l/L,再加入5μL Aβ(1-40)纖維溶液。在對以上混合液測熒光強度前,先在室溫下培育1min。測熒光強度的條件為:狹縫寬2 nm,當發(fā)射波長為456 nm時,激發(fā)波長為380 nm;掃描范圍410～620 nm。每個濃度的溶液平行做3份,每份測3次,取平均值。根據(jù)得到的溶液濃度-熒光強度,采用MicrocalO rigin 6.0軟件作雙倒數(shù)圖,得到解離常數(shù)Kd值。

2.5 99Tcm(CO)3+-flavone在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

取0.1 m L(約 177 kBq)所合成的99Tcm(CO)3+-flavone的生理鹽水溶液,由尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。分別于注射后2、30、60和120 min時斷頸處死小鼠,分別測定血液及各個臟器(肝、腎、骨、腦)的質(zhì)量和放射性計數(shù),并計算每克組織或器官的放射性攝取(%ID/g),以1%ID作為標準。每個時相平行3只小鼠,取平均值,并計算標準偏差。

3 結(jié)果和討論

3.1 化學合成結(jié)果

化合物A 、B、C、D、E 按照圖 1所示的路線制備,并用1HNMR、13CNMR、ESI-MS 和 IR 分析表征。

3.1.1 羥乙基胺基二乙酸叔丁酯(A) IR:3 438.3 cm-1、2 978.5 cm-1、2 933.7 cm-1、1 456.8 cm-1、1 393.6 cm-1、1 732.0 cm-1、1 368.6 cm-1、1 223.5 cm-1、1 070.9 cm-1、1 150.5 cm-1。1HNMR(CDCl3,400 MH z):3.90(s,1H)、3.53(t,J=5.1 Hz,2H)、3.45(s,4H)、2.89(t,J=5.1 H z,2H)、1.47(s,18H)。13CNMR(CDCl3,400 MH z):δ28.13、56.64、57.07、59.34、81.49 、171.46。MS:m/z 290.3[M+H]+、234.3[M+H-C(CH 33]+。3.1.2 溴乙基胺基二乙酸叔丁酯(B) IR:3 467.8 cm-1、2 977.3 cm-1、1 709.0 cm-1、1 439.2 cm-1、1 368.2 cm-1、1 159.4 cm-1、1 120.8 cm-1、725.0 cm-1、542.9 cm-1。1HNMR(CDCl3,400 MH z):3.51(s,4H)、3.46(t,J=7.5,3H)、3.16(t,J=7.4,3H)、1.47(s,18H)。13CNMR(CDCl3,400 MHz):δ28.17、30.21 、56.52 、56.73 、81.24、170.45。MS:m/z 352.0[M+H,79Br]+、354.1[M+H,81Br]+、272.2[M-Br]+。

3.1.3 乙-苯基-3-(二叔丁基二乙酸基胺基)乙氧基-4-氧代-苯并吡喃(C) IR:2 977.5 cm-1、2 928.1 cm-1、1 729.5 cm-1、1 640.2 cm-1、1 613.8 cm-1、1 467.9 cm-1、1 393.2 cm-1、1 367.8 cm-1、1 223.9 cm-1、1 147.7 cm-1、1 031.4 cm-1、760.6 cm-1。1HNMR(CDCl3,400 MHz):8.20(d,J=32 Hz,1H)、8.15(d,J=6 Hz,1H)、8.13(d,J=6Hz,1H)、7.67(m,1H),7.51(m,4H),7.40(t,J=8 H z,1H)、4.19(t,J=8 Hz,2H),3.52(s,4H)、3.13(t,J=8 Hz,2H)、1.43(s,18H)。13CNMR(CDCl3,400 MHz):δ170.61 、155.75、140.66、133.36、131.06、130.65、128.77、128.48、125.86、124.61、124.28 、118.00 、80.85、70.82、69.76、66.36、56.21、53.99、28.18。MS:m/z 532.4[M+Na]+、510.4[M+H]+、454.4[M+H-C(CH3)3]+、398.4[M+2H-2C(CH3)3]。

3.1.4 乙-苯基-3-(二羧基胺基)乙氧基-4-氧代-苯并吡喃(D) IR:3 435.6 cm-1、2 975.6 cm-1、2 928.1 cm-1、2 871.2 cm-1、1 731.7 cm-1、1 640.7 cm-1、1 614.7 cm-1、1 468.4 cm-1、1 446.6 cm-1、1 201.3 cm-1、1 148.3 cm-1、834.0 cm-1、694.1 cm-1。1HNMR(CD3OD,400 MH z):8.09(m,3H)、7.71(m,1H)、7.60(m,1H)、7.47(s,3H)、7.40(m,1H)、4.02(t,J=5 Hz,2H)、3.74(s,1H)、3.54(s,1H)、3.37(t,J=7 H z,2H)、3.23(s,4H)。13CNMR(CD3OD,400 MH z):δ176.92 、172.97、172.25、156.89、141.60、135.28、132.39 、129.87 、129.82 、126.33 、119.49 、82.24 、71.90、70.59、61.52、57.16、55.13。 MS:m/z 398.3[M+H]+。

3.1.5 Re(CO)3+-flavone(E) IR:3 429.8 cm-1、2 956.8 cm-1(Re-CO)、2 924.6 cm-1(Re-CO)、2 852.4 cm-1(Re-CO)、2 010.0 cm-1(酯基,C=O)、1994.5 cm-1(苯并吡喃,C=O)、1 881.1 cm-1(C—O)、1 685.4 cm-1(C=C)、1 541.3 cm-1(C-N)、1 490.5 cm-1、 1 438.2 cm-1、1 207.0 cm-1(苯并吡喃C-H)、1 135.7 cm-1(苯并吡喃C-H)、1 016.8 cm-1(苯并吡喃CH)、842.1 cm-1(苯環(huán) C-H)、801.9 cm-1(苯環(huán) C-H)、732.9 cm-1(苯環(huán) C-H)。1HNMR(CD3OD,400 MHz):7.35(m,3H,苯并吡喃)、7.26(m,3H,苯環(huán))、6.88(m,2H,苯環(huán))、3.73(s,4H,O=C-CH 2-N)、3.67(t,2H,-CH2-O)、3.00(t,2H,-CH 2-N)。13CNMR(CD3OD,400 MH z):δ199.90(Re-CO)、198.83(Re-CO)、178.43(酯基,C=O)、158.29(苯并吡喃,C=O)、157.99、134.20、131.03、128.68、128.42、125.15、125.00、124.15、121.73、118.75、118.42、115.77、68.81、63.26、45.66。MS(187/185Re,ES-):m/z 666.4、664.6[M]-。

3.2 HPLC分析

化合物 Re(CO)3+-flavone、99Tcm(CO)3+-flavone和化合物D HPLC-UV分析譜圖示于圖2。由圖2b可知,99Tcm(CO)3+-flavone保留時間為3.2 min,計算得99Tcm(CO)3+-flavone的放化純度＞95%。與Re(CO)3+-flavone(保留時間=3.2min,HPLC-UV在λ=254 nm 處,圖2a)和標記前體化合物D(保留時間=7.4 m in,HPLC-UV在λ=254 nm處,圖2c)比較可知,Re(CO)3+-flavone與99T cm/Re(CO)3+-flavones有相同的結(jié)構(gòu)。

圖2 標記物的Radio(UV)-HPLC分析結(jié)果a—— Re(CO)3+-flavone;b——99Tcm(CO)3+-flavone;c——化合物 D

3.2.1 Aβ纖維的制備結(jié)果 Aβ(1-40)聚集前后的電鏡圖像分別示于圖3a和圖3b,在透射電鏡下觀察到Aβ(1-40)聚集成了纖維狀結(jié)構(gòu)。硫磺素-T溶液熒光圖示于圖4.由圖4可知,當 5μL Aβ(1-40)纖維溶液加到 500μL硫磺素 T(4μm ol/L)溶液中時,在485 nm處熒光強度有明顯加強,此現(xiàn)象也表明Aβ(1-40)纖維的形成。

3.2.2 Re(CO)3+-flavone與Aβ纖維的結(jié)合能力 通過錸配合物的紫外-可見吸收及熒光發(fā)射性質(zhì),找到了錸配合物的最佳激發(fā)波長,在此最佳激發(fā)波長(420 nm)下,測每個濃度的錸配合物溶液,及加入Aβ(1-40)纖維溶液后的熒光強度,結(jié)果示于圖5。由圖5可見,加入 Aβ(1-40)纖維后,錸配合物溶液的熒光信號顯著增強,且發(fā)射波長的位置幾乎沒有變化(460～458 nm),說明Re(CO)3+-flavone與Aβ纖維的結(jié)合。

圖3 Aβ(1-40)聚集前后的電鏡圖像a——單體 Aβ(1-40),b——纖維狀聚集的 Aβ(1-40)

圖4 硫磺素-T溶液熒光圖

圖5 錸配合物溶液的熒光強度

以錸配合物的濃度的倒數(shù)(1/C)為橫坐標,以錸配合物與Aβ(1-40)纖維結(jié)合后和結(jié)合前的熒光強度差值(E)的倒數(shù)(1/F)為縱坐標,用Origin 6.0軟件作雙倒數(shù)圖,結(jié)果示于圖6。直線與x軸的交點為-1/K d,擬合圖6得到直線方程為y=3.460 31×10-4+0.001 88 x,R=0.973 97,s=3.663 29×10-5,P=0.026 03,F=36.925 73。直線方程中y為熒光增強的倒數(shù);x為濃度的倒數(shù);R為線性相關(guān)系數(shù);s為標準偏差;F為錸配合物與Aβ(1-40)纖維結(jié)合后和結(jié)合前的熒光增強。

圖6 錸配合物溶液濃度-熒光強度雙倒數(shù)圖

由此方程得到錸配合物與Aβ(1-40)纖維結(jié)合的解離常數(shù):

此結(jié)果表明,錸配合物與Aβ(1-40)纖維作用的解離常數(shù)在nmol/L級,說明二者的相互作用很強。

幾種化合物與Aβ纖維結(jié)合的抑制常數(shù)列于表1。由表1可知,與放射性碘標記的黃酮和苯乙烯基色酮衍生物相比較,Re(CO)3+-flavone與Aβ纖維結(jié)合力更強。

3.3 99Tcm(CO)3+-flavone在小鼠體內(nèi)的生物分布

99Tcm(CO)3+-f lav one 在正常小鼠體內(nèi)的生物分布列于表 2。由表 2可以看出,99Tcm(CO)3+-flavone在腦內(nèi)的初始攝取值高(2 min時為0.46±0.23%ID/g),且清除迅速(120 min時,腦內(nèi)放射性攝取只有0.13±0.04%ID/g)。此外,99Tcm(CO)3+-flavone在其他器官內(nèi)也清除較快。其在正常小鼠體內(nèi)初始攝取值較高,代謝較快,預示化合物具有較高的信噪比,有望成為Aβ成像探針。

表1 化合物與Aβ纖維結(jié)合的抑制常數(shù)

表2 99Tcm(CO)3+-f lavone在正常小鼠體內(nèi)的生物分布(±s,n=3)

表2 99Tcm(CO)3+-f lavone在正常小鼠體內(nèi)的生物分布(±s,n=3)

不同時間的放射性攝取/(%ID·g-1)器官2m in 30 m in 60 m in 120m in腦 0.46±0.23 0.35±0.05 0.23±0.06 0.13±0.04血 6.16±0.10 3.58±0.57 2.05±0.06 1.39±0.73骨 3.34±1.89 1.67±0.21 0.95±0.05 0.82±0.16肝 2.33±0.47 2.05±0.23 1.11±0.28 1.56±0.47腎 3.47±0.92 2.42±0.54 1.93±0.44 2.04±0.59

4 結(jié) 論

(1)設(shè)計并合成了新型的與Re(CO)3+同型的99Tcm(CO)3+黃酮衍生物作為 Aβ斑塊SPECT顯像候選物。

(2)合成了相應的錸配合物以證明其結(jié)構(gòu),研究了其相應的錸配合物Re(CO)3+-flavone的紫外和熒光性質(zhì),利用熒光方法得到了 Re(CO)3+-flavone與Aβ(1-40)纖維的體外親和力達5.43 nmol/L。

(3)99Tcm(CO)3+-flavone在正常小鼠體內(nèi)注射后2～120 min,有較高的腦攝取量和快速清除。

以上特點表明,99Tcm標記的黃酮類似物作為體內(nèi)Aβ斑塊顯像劑值得進一步研究。

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