盧 霞,王榮福,張春麗

(1.北京大學(xué) 第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,北京 100034;2.北京航天總醫(yī)院 影像中心,北京 100076)

惡性腫瘤是目前導(dǎo)致患者死亡最主要的疾病之一,在全世界的發(fā)病率仍然呈持續(xù)增長的勢頭。分子功能顯像綜合了分子生物學(xué)、合成化學(xué)及可視化技術(shù)的優(yōu)勢,在腫瘤的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域、臨床前研究及臨床研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值。示蹤劑的敏感性和特異性是目前腫瘤診斷及治療研究的難點(diǎn)。

腫瘤新生血管生成是維持腫瘤快速生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不可缺少的重要因素,已經(jīng)引起越來越多研究者的關(guān)注。大多數(shù)研究都致力于發(fā)現(xiàn)能夠示蹤腫瘤新生血管生成的新型腫瘤示蹤劑。放射性核素標(biāo)記的單克隆抗體示蹤腫瘤新生血管內(nèi)皮特征分子是腫瘤新生血管示蹤的主要研究方向。與放射性核素標(biāo)記單克隆抗體相比,核素標(biāo)記多肽相對分子質(zhì)量小,能夠更容易進(jìn)入其作用的靶點(diǎn)[1]。Brow n等[2]利用大腸桿菌肽展示文庫發(fā)現(xiàn)了小分子肽片段精氨酸-精氨酸-亮氨酸(Cys-Gly-Gly-A rg-A rg-Leu-Gly-Gly-Cys,RRL)能夠特異性結(jié)合于腫瘤來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞,而與正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞不結(jié)合。已有研究者[3]將氣體微泡(MB)連接于 RRL多肽,通過RRL特異性結(jié)合于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì),進(jìn)行腫瘤新生血管顯像。其研究結(jié)果顯示,腫瘤血管來源的內(nèi)皮細(xì)胞中,MB-RRL的結(jié)合量是對照組及心肌組織中的3倍多。MB-RRL能夠優(yōu)先結(jié)合于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞,能夠示蹤腫瘤新生血管的形成,有潛在的腫瘤血管靶向治療應(yīng)用可能性。

本課題組在放射性核素標(biāo)記RRL方面已經(jīng)做了一些嘗試性研究[4]。研究結(jié)果顯示,修飾小分子肽RRL的原有結(jié)構(gòu),在其氨基端添加一個(gè)酪氨酸,變成包含十個(gè)氨基酸的小肽,能夠被放射性核素131I標(biāo)記,且標(biāo)記物能選擇性地濃聚于腫瘤組織內(nèi)。本工作擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步評價(jià)131I-RRL體外的生物學(xué)特性及與腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系;進(jìn)行體內(nèi)黑色素瘤腫瘤模型動物SPECT成像,了解標(biāo)記物在腫瘤分子成像中的價(jià)值。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

RM 905型活度計(jì):中國計(jì)量科學(xué)研究院提供;ND-1000型分光光度計(jì):美國NanoDrop Technologies公司產(chǎn)品;SPECT顯像儀(GEMRP):美國 GE公司產(chǎn)品;CO2孵箱:美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)超凈工作臺:美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡CK 40、FV 1000激光共聚焦顯微鏡:Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

氯胺-T:分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;Na131I溶液:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;RRL多肽:純度大于99%,北京中科亞光生物技術(shù)公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純,購自北京化學(xué)試劑公司。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)、黑色素瘤細(xì)胞(B16)、人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC):購自南京凱基生物有限公司;胎牛血清:美國Gibco公司。

1.3 荷瘤裸鼠模型制備

BALB/c裸鼠:雄性,4～6周齡,20～22 g,SPF級,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。每只裸鼠左前肢皮下接種B16細(xì)胞(1×107),待腫瘤直徑長至0.8～1.0 cm時(shí)進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多肽RRL的131I標(biāo)記

采用氯胺-T法進(jìn)行 RRL的131I標(biāo)記。于81μL 0.5 mol/L的PB(pH 7.4)中加入 50μg RRL多肽,待多肽完全溶解后加入 10μL(74 MBq)Na131I,然后加入 9μL(0.9 g/L)新鮮配制的氯胺-T,振蕩反應(yīng)2m in,用45μL(4 g/L)偏重亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。

固定其他標(biāo)記條件不變,分別延長標(biāo)記時(shí)間,改變氯胺-T的濃度及反應(yīng)總體積,進(jìn)行標(biāo)記條件的優(yōu)化,以獲得較高的標(biāo)記率。

將標(biāo)記的混合產(chǎn)物用經(jīng)牛血清白蛋白(Bovine Serum A lbumin,BSA)飽和,0.05mol/L、pH 7.4的PBS平衡3次的Sephadex G25柱純化分離,流動相用0.05 mol/L(pH 7.4)PBS沖洗,洗脫液用高壓滅菌EP管逐管連續(xù)收集(每0.5 m L,共20管)。分光光度計(jì)分析每管多肽含量,活度計(jì)測量每管放射性活度。收集高峰管(OD280值以及放射性活度值均最高的管),即為標(biāo)記產(chǎn)物131I-RRL。

采用紙層析法測定標(biāo)記物的標(biāo)記率及放化純度。新華1號層析紙為固定相,V(丙酮)∶V(NS)=3∶1為展開劑,采用γ放射免疫計(jì)數(shù)器測量各段放射性計(jì)數(shù),計(jì)算標(biāo)記率(純化前標(biāo)記物峰的計(jì)數(shù)占各峰總計(jì)數(shù)的百分比)和放化純度(純化后標(biāo)記物峰的計(jì)數(shù)占各峰總計(jì)數(shù)的百分比)。

2.2 多肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)

小分子多肽RRL合成過程中,在其羧基端連接綠色熒光素(FITC),形成標(biāo)記多肽FITCRRL,進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞和正常組織對照細(xì)胞,待細(xì)胞生長狀態(tài)良好、處于指數(shù)生長期時(shí),將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板中,使細(xì)胞完全貼壁。加入FITC-RRL(2 mg/L)與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h,此后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30min,PBS(0.05 mol/L,pH 7.4)輕輕漂洗細(xì)胞3次;用0.1%的T ritonX-100對細(xì)胞進(jìn)行透膜,使得染料能夠進(jìn)入細(xì)胞核,用PBS輕輕漂洗細(xì)胞3次;用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diam idino-2-pheny lindole,DAPI)染核。在激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC-RRL在腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞和正常對照細(xì)胞中的結(jié)合狀況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 SPECT顯像

取3只荷瘤BA LB/c裸鼠,于顯像前3天用含1%的碘化鉀(K I)的飲水,對模型動物的甲狀腺進(jìn)行封閉。每只荷瘤鼠腹腔注射 444 MBq131I-RRL多肽。分別于注射后6、12和24 h俯臥位進(jìn)行全身靜態(tài)SPECT顯像。采集條件:能峰365 keV,窗寬 20%,矩陣256×256,放大倍數(shù)2.0,每只裸鼠采集105計(jì)數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 多肽標(biāo)記結(jié)果

采用氯胺-T法標(biāo)記RRL多肽。最佳標(biāo)記條件為:多肽用量 50μg,Na131I用量10μL(74 MBq),氯胺-T用量 90μg,反應(yīng)總體積100μL,振蕩反應(yīng) 3m in。標(biāo)記率＞69%。用Sephadex G25柱對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,分光光度計(jì)對多肽含量進(jìn)行分析,結(jié)果示于圖1。由圖1a可以看出,第2管放射性計(jì)數(shù)達(dá)峰值,第5管后放射性計(jì)數(shù)已很低。由圖1b可見,吸收峰形成于2、3、4管,峰值位于第2管,此峰與活度計(jì)檢測結(jié)果的峰吻合,驗(yàn)證了淋洗出的化合物是131I標(biāo)記的多肽RRL。優(yōu)化標(biāo)記條件后,131I標(biāo)記RRL的標(biāo)記率達(dá)到 69%,與前期實(shí)驗(yàn)標(biāo)記率60%[4]相比有所提高。放化純度大于95%。131I是最早應(yīng)用于臨床的核素之一,不僅可以用于顯像診斷,也是應(yīng)用于放射性核素治療的最重要的核素。在甲狀腺功能亢進(jìn)癥和甲狀腺腫瘤的治療中有著廣泛的臨床應(yīng)用及良好的治療效果。131I的物理半衰期為8.04 d,發(fā)射γ和β兩種射線,發(fā)射的γ射線的能量為 365 keV,可用于SPECT顯像;發(fā)射的β射線能量為607 keV,能量較高,能夠用于甲狀腺功能亢進(jìn)癥及腫瘤的治療;而且131I能夠大量生產(chǎn),價(jià)格低廉,因而有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.2 FITC-RRL體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

圖1 131I-RRL純化結(jié)果

FITC-RRL與不同種類細(xì)胞在37℃孵育24 h后,其熒光顯色結(jié)果示于圖2。綠色熒光素通過小分子肽RRL與細(xì)胞特異性的結(jié)合作用而被細(xì)胞攝取,細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度的差異與細(xì)胞攝取綠色熒光素的能力及小分子多肽RRL的能力大小呈正相關(guān)。由圖2可知,具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及肝癌細(xì)胞(HepG2)株中,呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的綠色熒光信號,與 RRL呈現(xiàn)中等量的結(jié)合;黑色素瘤細(xì)胞(B16)株中呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光信號,與RRL呈現(xiàn)大量的結(jié)合;正常血管內(nèi)皮對照細(xì)胞(HAEC)中綠色信號很弱,與RRL結(jié)合量很少。

文獻(xiàn)[2]報(bào)道,FITC標(biāo)記的RRL能夠與腫瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞大量結(jié)合,氣體微泡連接的RRL與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合量是正常心肌細(xì)胞的3倍多[3]。本實(shí)驗(yàn)中,盡管RRL在HUVEC細(xì)胞中有大量的攝取,但是與惡性黑色素瘤腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞大量結(jié)合 RRL相比,FITCRRL與HUVEC呈中等量的結(jié)合,FITC-RRL與正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞即人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)幾乎不結(jié)合,與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致。此外,圖2還顯示,結(jié)構(gòu)修飾的RRL(氨基末端連接酪氨酸)除與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合之外,還能夠與腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞,包括鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)和人肝癌細(xì)胞株(HepG2)結(jié)合,此現(xiàn)象在國內(nèi)外均未見報(bào)道。RRL能夠特異性地與腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞及腫瘤來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,通過一定的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入細(xì)胞后,可能與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的共同受體蛋白質(zhì)結(jié)合。文獻(xiàn)報(bào)道,在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞及某些腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞中,均發(fā)現(xiàn)有血管內(nèi)皮生長因子受體2亞型(Vascular Endothelial Grow th Factor 2,VEGFR-2)特異性高表達(dá)[5]。RRL準(zhǔn)確的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

圖2 FITC-RRL在腫瘤細(xì)胞與正常對照細(xì)胞結(jié)合熒光顯色結(jié)果

3.3 SPECT顯像

在黑色素瘤(B16)腫瘤模型動物注射131IRRL后不同時(shí)間點(diǎn),腫瘤顯像結(jié)果示于圖3。由圖3可見,腹腔注射131I-RRL后6 h SPECT顯像,腹腔內(nèi)可見大量放射性核素濃聚;12 h腫瘤組織可見放射性核素濃聚,24 h腫瘤組織有明顯的放射性顯像劑存留。在前期實(shí)驗(yàn)[4]研究中證實(shí),由尾靜脈給前列腺癌腫瘤模型動物BALB/c裸鼠注射131I-RRL后,隨著時(shí)間的延長,除了腫瘤組織以外其余組織放射性活度都明顯下降。腫瘤對131I標(biāo)記的RRL在6、24 h的攝取明顯高于對131I標(biāo)記的對照肽GGG的攝取。隨著注射顯像劑后時(shí)間的延長,RRL多肽的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉的 T/NT比值逐漸升高,至24 h時(shí)分別達(dá)到1.3和9.1;而對照肽的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉的 T/NT比值無升高趨勢。

在本研究小組前期的實(shí)驗(yàn)研究[4]中發(fā)現(xiàn)131I-RRL體內(nèi)穩(wěn)定性好。生物分布結(jié)果顯示,131I-RRL注入體內(nèi)24 h后,主要滯留在腫瘤組織內(nèi),其他組織器官分布較少。本實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射顯像劑131I-RRL 444 MBq后,6 h顯像,放射性藥物主要濃聚于腹腔內(nèi),腫瘤組織分布較少;12 h顯像,腹腔內(nèi)放射性聚集明顯降低,腫瘤組織顯像;24 h后顯像,腫瘤組織放射性濃聚灶清晰可見。RRL不但如文獻(xiàn)報(bào)道,能夠大量結(jié)合于腫瘤來源血管內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)還能夠與多種不同組織來源的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞結(jié)合,特異性地濃聚于腫瘤組織內(nèi),是很有前景的腫瘤小分子多肽顯像劑。

圖3 注射131I-RRL后不同時(shí)間點(diǎn)黑色素瘤模型鼠SPECT成像

4 結(jié) 論

(1)RRL不僅能夠與腫瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,更重要的是能夠與不同組織來源的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞結(jié)合。

(2)131I-RRL不但對于前列腺癌有肯定的顯像效果,也能夠特異性濃聚于黑色素瘤模型鼠的腫瘤組織內(nèi),對惡性黑色素瘤有肯定的顯像效果。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,RRL不僅是一種新型的腫瘤新生血管顯像劑,而且是一種值得繼續(xù)深入研究的廣譜腫瘤分子靶向顯像劑,具有應(yīng)用于腫瘤放射免疫治療的可能性。

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