王美英

三代頭孢菌素如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶和單環(huán)酰胺類抗生素如氨曲南在臨床上廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致對這類抗生素耐藥的細(xì)菌不斷增多，其主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生了能水解氧亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素的超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(extended-epectrum βlactamases，ESBLs)。產(chǎn)ESBLs菌常具多重耐藥性，易導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)流行，且流行狀況及耐藥性存在地區(qū)差別，并對三代頭孢菌素表現(xiàn)敏感而誤導(dǎo)治療，故被認(rèn)為是革蘭陰性菌中最危險的耐藥形式。因此，了解我市兒科患者分離的腸桿菌科細(xì)菌中ESBLs的流行和分布情況，以及產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型別及最佳檢測底物及耐藥性特點，從而防止產(chǎn)

ESBLs株的區(qū)域性流行，指導(dǎo)臨床治療，以免延誤病情和造成浪費(fèi)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株:2006年1月至2009年12月，河北省保定市兒童醫(yī)院患者標(biāo)本中分離出的耐藥性腸桿菌科細(xì)菌。ESBLs敏感菌標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922，ESBLs檢測質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603(產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株)

1.1.2 試劑:革蘭陰性桿菌培養(yǎng)基:中國蘭瓊脂平板(英國Oxoid公司)。藥敏M-H瓊脂培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)。營養(yǎng)肉湯(英國Oxoid公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備及器械:全自動血培養(yǎng)儀(法國生物梅里埃公司);VITEK 2全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司);PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司);水平凝膠電泳槽(日本ATTO公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離、培養(yǎng)、鑒定:所有標(biāo)本按常規(guī)接種，VITEK2全自動微生物分析儀鑒定。

1.2.2 ESBLs表型篩選試驗:選用頭孢泊肟(CPD)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、胺曲南(ATM)、頭孢曲松(CAX)藥敏紙片(均 30 μg/片)，用 Mueller-Hinton瓊脂，改良 Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法測試抑菌環(huán)直徑。凡頭孢泊肟或頭孢他啶的抑菌環(huán)直徑≤22 mm，或頭孢曲松≤25 mm，胺曲南或頭孢噻肟≤27 mm，均應(yīng)高度懷疑為產(chǎn)ESBLs菌株，需進(jìn)一步做確證試驗來加以確證。

1.2.3 ESBLs表型確證試驗:按1999年1月NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散確證法測定ESBLs指南操作，用CAZ(30 μg/片)和CAZ+CAZ/CLV(30 μg/10 μg)組合、CTX(30 μg/片)和 CTX+CTX/CLV(30 μg/10 μg)組合，分別測量2種紙片加 CTX/CLV后的抑菌環(huán)直徑。對2個中任何一個藥物加CTX/CLV后抑菌環(huán)的直徑差≥5 mm時，可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.2.4 ESBLs基因 PCR 擴(kuò)增

1.2.4.1 DNA模板制備:用于擴(kuò)增整合子的整合酶及相關(guān)基因盒的模板制備方法。如下:挑取單個菌落置入內(nèi)含150 μl裂解液(0.5%非離子去污劑NP40配制的濃度為200 ng/ml蛋白酶K溶液)的0.5 ml離心管內(nèi)，置55℃水浴消化1 h。然后置95℃水浴滅活15 min。14 000 r/min離心30 s。吸取上清液，即為基因擴(kuò)增檢測的模板液。

1.2.4.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):①采用25 μl反應(yīng)體系擴(kuò)增目的基因，引物序列見表 1;②TEM-1、SHV-11、OXA-10、CTX-M-3為陽性對照，大腸埃希菌(ACTT 25922)為陰性對照;③TEM、SHV、OXA、VEB和PER基因擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)均為94℃預(yù)變性3 min;94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，循環(huán) 35 次;最后72℃延伸10 min。CTX-M基因擴(kuò)增的退火溫度為50℃，其余參數(shù)不變。

1.2.4.3 電泳:反應(yīng)產(chǎn)物5 μl與1 μl 6 × 嗅酚藍(lán)上樣緩沖液混合點入1.0%瓊脂糖的點樣孔中，1×TAE中100 V電泳35 min，溴化乙啶染色(0.5 μg/ml)30～40 min后在紫外燈下觀察結(jié)果并攝像。設(shè)ECO ATCC 25922及空白為陰性對照，標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)酶ECO(TEM、SHV-2、SHV-7、SHV-12、CTX-M)分別為陽性對照。

表1 PCR擴(kuò)增ESBLs基因引物名稱引物序列片段長度

2 結(jié)果

2.1 ESBLs表型試驗結(jié)果 見表2。

表2 1 677株細(xì)菌的ESBLs檢測

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 見表3、4。

表3 750株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型株(%)

表4 750株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型分布 株

3 討論

廣譜抗生素特別是三代頭孢菌素在臨床上的廣泛使用，使得質(zhì)粒介導(dǎo)的產(chǎn)ESBLs細(xì)菌在我國不同地區(qū)廣泛傳播［1］。產(chǎn)ESBLs細(xì)菌不僅對三代頭孢類抗生素均耐藥，而且由于細(xì)菌攜帶ESBLs質(zhì)?？赏瑫r帶有對喹諾酮類、胺基糖甙類和磺胺類等多種抗生素的耐藥基因，致使產(chǎn)ESBLs細(xì)菌具有多種不同的耐藥表型。ESBLs主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌最為常見。近年來，產(chǎn)ESBLs的菌株呈逐年增加的趨勢，葉素娟等［2］報道，國內(nèi)8所較有代表性的綜合性醫(yī)院2005年臨床分離的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的檢出率分別為38.9%、40.5%，不同醫(yī)院ESBLs檢出率不盡相同，其耐藥性明顯高于非產(chǎn)ESBLs株。本組資料顯示，我院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌檢出率為45.4%、43.9%。一般認(rèn)為碳青霉烯類、頭霉(類抗生素以及β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸等可用于治療產(chǎn)ESBLs細(xì)菌所致感染。本組資料藥敏結(jié)果也顯示，產(chǎn)ESBLs菌株對亞胺培南全部敏感，故碳青霉烯類抗生素可作為治療危重患兒的首選藥物，對頭孢西丁、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和阿莫西林/克拉維酸保持較低的耐藥率，亦可作為治療產(chǎn)ESBLs細(xì)菌引起感染的理想藥物;但產(chǎn)ESBLs菌株對氨芐西林/舒巴坦的耐藥率為44.3%，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果使用;在本組資料中，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星的耐藥率為30%，低于報道［2］，可能此類抗菌藥物對兒童不良反應(yīng)較多，兒童感染患者較少單獨(dú)使用有關(guān);同時顯示大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的耐藥率明顯高于肺炎克雷伯菌。國內(nèi)許多研究顯示，主要流行的ESBLs基因型為CTX-M型，但流行的亞型不盡相同，如葉惠芬等［3］報道，流行的ESBLs基因型主要是 CTX-M-14 和 SHV-12;韓珍等［4，5］報道，北京醫(yī)院和浙江地區(qū)主要為CTX-M-14，其次為SHV型，TEM型均為TEM-1型。本試驗顯示我院流行的ESBLs基因型主要為CTXM型，且以CTX-M-14基因型最多，，SHV基因型中SHV-5最多，本研究結(jié)果顯示，共檢出8種ESBLs基因型;750株產(chǎn)ESBLs細(xì)菌中，57.3%(430/750)菌株產(chǎn)單一基因型，42.7%(320/750)的菌株產(chǎn)2種或2種以上的基因型。ESBLs亞型在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中的分布存在差異，SHV型幾乎全部來自于肺炎克雷伯菌，CTX-M型主要出現(xiàn)在大腸埃希菌。CTX-M型菌株對CTX的耐藥率明顯高于SHV型，CTX-M型ESBLs最主要的特點是高度水解CTX，而2種細(xì)菌對CTX的耐藥表型顯示耐藥率差別不大，此種差別可能是產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中有22%的菌株為產(chǎn)CTX-M+SHV型基因，保定市尚未見ESBLs基因型方面的報道。值得注意的是TEM、SHV、CTX-M、OXA型基因雙陽性及3陽性的比率高達(dá)50%，原因可能為:質(zhì)粒上有≥2種ESBLs的編碼基因或產(chǎn)ESBLs菌株同時產(chǎn)TEM-1、TEM-2或SHV-1型廣譜酶，這一現(xiàn)象有待于將來進(jìn)一步深入探討。

1 常殿武，李明成.兒科院內(nèi)感染肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰酶基因型檢測及分析.山東醫(yī)藥，2008，48:71-72.

2 葉素娟，楊青，俞云松.2005年中國CHINET大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性分析.中國感染與化療雜志，2007，7:283-286.

3 葉惠芬，陳惠玲，劉平，等.產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性和基因型分布.中國感染與化療雜志，2007，7:127-129.

4 韓珍，李向陽，楊錦紅，等.臨床產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥表型及基因型的研究.檢驗醫(yī)學(xué)，2008，23:397-340.

5 季淑娟，陳亞崗，俞云松，等.浙江省產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因分型.中華傳染病雜志，2005，23:75-78.