廖麗晶 金 崑

(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京，100091)

胡慧建 張于光 張 亮

(華南瀕危動(dòng)物研究所)(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所)(華南瀕危動(dòng)物研究所)

亞洲黑熊(Ursus thibetanus)也稱黑熊，隸屬食肉目熊科(Ursidae)，生活在潮濕的叢林地區(qū)，是亞熱帶常綠闊葉林的典型物種，主要分布于俄羅斯與亞洲的印度、尼泊爾、日本、朝鮮、阿富汗和中國。目前亞洲黑熊已經(jīng)被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ，為《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》易危種，是我國二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。在我國分布有5個(gè)地理亞種，即指名亞種(西藏黑熊)(S.t.thibetanus)、長(zhǎng)毛亞種(喜峰黑熊)(S.t.laniger)、四川亞種(S.t.mupinensis)、臺(tái)灣亞種(S.t.formosanus)和東北亞種(S.t.ussuricus)［1－2］。根據(jù)各地縣志所記，上個(gè)世紀(jì)50年代以前，亞洲黑熊在廣東分布很廣泛，從粵北山區(qū)到南海之濱，從粵東到粵西都有黑熊的分布［3］。廣東車八嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于廣東省北部始興縣境內(nèi)，地理位置為東經(jīng) 114°07'39″～ 114°16'46″，北緯 24°40'29″～24°46'21″，東面與江西省全南縣接壤，是南嶺南緣保存較完整、面積較大、分布較集中、原生性較強(qiáng)的具有代表性的中亞熱帶常綠闊葉林。1926年始興縣縣志中有黑熊的記載，說明車八嶺地區(qū)當(dāng)時(shí)還有黑熊分布。但是1992—1994年進(jìn)行的廣東黑熊資源專項(xiàng)調(diào)查以及后來的野生動(dòng)物資源調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)廣東黑熊僅分布于粵北山地林區(qū)的乳源、陽山、連縣、曲江、英德、樂昌6個(gè)縣市的范圍內(nèi)［3］。本研究通過分子鑒定確定車八嶺保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)的爪鞘來自亞洲黑熊，為近20 a來首次在該地區(qū)發(fā)現(xiàn)亞洲黑熊存在的痕跡，表明該地區(qū)森林生態(tài)環(huán)境不斷改善，亞洲黑熊的種群正在恢復(fù)。

1 材料與方法

材料 爪鞘來自于車八嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的仙人洞村附近山脊，是2010年4月23日華南瀕危動(dòng)物研究所在開展國家林業(yè)局調(diào)查試點(diǎn)項(xiàng)目時(shí)所發(fā)現(xiàn)。因難以把握爪鞘特征，且在傳統(tǒng)的外形對(duì)比情況下，無法確定其物種，故采用分子鑒定方法進(jìn)行鑒別。

試劑 DNA IQTM系統(tǒng)試劑盒、蛋白酶K和DTT來自Promega公司;QIAquick凝膠回收試劑盒來自Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP來自天根公司;常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

爪鞘DNA提取 內(nèi)壁刮取適量爪鞘(5.0 mg)置2.0 mL離心管，加入1.5 mL 10%SDS浸泡30 min，去離子，水沖洗3～5次，確保表面粘附的細(xì)胞完全去除。然后加入200 μL DNA IQTM系統(tǒng)裂解液、20 μL 10 g/L 蛋白酶 K、20 μL 1 mol/L DTT，56℃水浴9 h，待裂解完全，95℃滅活10 min。套管離心后取上清液，按DNA IQTM系統(tǒng)試劑盒操作手冊(cè)提取模板DNA，并溶解于50 μL洗脫液中。

PCR擴(kuò)增和測(cè)序 選擇食肉目線粒體Cyt b基因的特異性引物進(jìn)行物種鑒定，引物對(duì)為CAT－CytB－F:5'－AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATTTGTCCTCA－3'和CAT－CytB－R:5'－TATTCTTTATCTGCCTATACATRCACG － 3'［4］。該引物目的片段大小為105～108 bp。PCR反應(yīng)體積為30 μL，體系中含有0.5 mmol/L 的 dNTPs、1.5 × PCR buffer、0.5 U 的 Taq 酶、1 μg的BSA、0.72 mmol/L的引物和2 μL模板 DNA。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性15 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段經(jīng)QIAquick凝膠回收試劑盒純化后送華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

物種鑒定和數(shù)據(jù)分析 通過MEGA 4.0軟件進(jìn)行線粒體DNA序列分析，去掉引物序列，得到目的片段序列。利用Genbank中的BLAST在數(shù)據(jù)庫中找到的參照序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)已有的研究，比對(duì)的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的已知序列同源性在97%以上時(shí)，確定與該序列的物種為相同種。

2 結(jié)果與分析

爪鞘DNA提取物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜如圖1所示。從爪鞘中提取的DNA，大小可達(dá)到400 bp以上，因?yàn)榻腔M織中提取出的DNA都會(huì)存在嚴(yán)重降解，因此電泳圖譜上出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。陰性對(duì)照(泳道4和泳道6)和空白對(duì)照(泳道3)未顯示出條帶，說明提取過程和擴(kuò)增過程中未受到污染。擴(kuò)增產(chǎn)物大小在150 bp左右(泳道1和泳道2)，符合目的片段大小。

圖1 爪鞘DNA和線粒體Cyt b擴(kuò)增電泳圖譜

測(cè)序結(jié)果通過MEGA 4.0軟件分析，去掉兩側(cè)引物序列，得到長(zhǎng)度為108 bp的目的片段，序列為5'－TAGGACGGGGCTTGTATTATGGCTCATACCTACTCTCAGAAACATGAAACATTGGCATCATCCTCCTACTTACAGTTATAGCCACCGCATTCATAGGATACGTCCTAC－3'。通過BLAST軟件將它與Genbank數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與數(shù)據(jù)庫中亞洲黑熊的Cyt b基因具有最好的相似性，其同源性為97.2% ～99.1%，相似度最高的是序列號(hào)為AB360957.1的亞洲黑熊線粒體Cyt b基因序列，序列一致性達(dá)到99.1%(圖2)。其次是美洲黑熊(Ursus americanus)，同源性在92% ～96%，最高達(dá)到95.4%，懶熊(Melursus ursinus)為85% ～91%。已有的研究表明，該序列可以用于食肉目動(dòng)物物種間鑒定，在同一物種內(nèi)的序列差異為 0 ～0.03，物種間的最小差異為 0.04［4，6－7］，由此可確定該爪鞘來自亞洲黑熊。亞洲黑熊在我國分布有5個(gè)地理亞種，廣東車八嶺地區(qū)為四川亞種(S.t.mupinensis)分布區(qū)域［1］，因此該爪鞘鑒定為亞洲黑熊四川亞種(S.t.mupinensis)。

3 結(jié)論與討論

爪鞘角化細(xì)胞內(nèi)的富含二硫鍵的角蛋白不易被破壞，同時(shí)細(xì)胞核已經(jīng)退化轉(zhuǎn)移，只有線粒體尚未完全退化轉(zhuǎn)移，給DNA提取造成一定的困難。本研究采用DNA IQTM系統(tǒng)裂解液、DTT以及蛋白酶K聯(lián)合消化的方法提取爪鞘DNA，加入DTT有助于打開角蛋白結(jié)構(gòu)中的二硫鍵，破壞細(xì)胞間連接和核膜，提高消化效率［8］。DNA IQTM系統(tǒng)采用順磁性樹脂吸附DNA，在磁場(chǎng)中可以徹底去除殘液，小片段DNA丟失較少，純化效率大大提高。

圖2 序列比對(duì)結(jié)果

目前常用的動(dòng)物物種鑒定方法有形態(tài)鑒定法、顯微鏡鏡檢法、理化檢驗(yàn)法以及DNA分析技術(shù)等。形態(tài)鑒定法是最常用也是最基礎(chǔ)的鑒定方法，可以對(duì)活體或者比較完整的尸體、毛皮或骨骼以及具有很特殊性狀的檢材做出較為準(zhǔn)確的鑒定，由于微觀形態(tài)在物種內(nèi)存在的差異性和復(fù)雜性，給顯微鏡鏡檢法的結(jié)果帶來了不確定性。而理化檢驗(yàn)檢測(cè)物質(zhì)的特定成分或者廣譜成分，需要大量的實(shí)驗(yàn)工作才能確定其標(biāo)準(zhǔn)范圍，為最終確定結(jié)論帶來了較大的風(fēng)險(xiǎn)或偏差［9］。DNA是生物的遺傳信息載體，分析結(jié)果不受樣品形態(tài)(無論原品、粉狀或片狀)和材料來源的影響，具有重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，而且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA序列數(shù)據(jù)庫也呈幾何數(shù)增長(zhǎng)，可為物種鑒定提供豐富的可比較的數(shù)據(jù)庫，使鑒定結(jié)果更具科學(xué)性和可靠性［10］。本試驗(yàn)所采用的引物曾經(jīng)成功地用于南美洲肉食動(dòng)物糞便樣品鑒定［4］，研究表明，該引物同樣可以用于亞洲的雪豹、赤狐、狼和猞猁等物種鑒定［6－7］。本研究中測(cè)序結(jié)果與Genbank中其他的亞洲黑熊的序列相似度都在97.2% ～99.1%范圍內(nèi)，與美洲黑熊的序列相似度最高在 95.4%，與 Farrell和張于光等［4，6－7］的研究結(jié)果相符，該序列在同一物種內(nèi)的序列差異為0～0.03，物種間的最小差異為0.04，說明該引物也適用于黑熊樣品的物種鑒定。

1992—1994年進(jìn)行的廣東黑熊資源專項(xiàng)調(diào)查以及后來的野生動(dòng)物資源調(diào)查中，車八嶺地區(qū)未發(fā)現(xiàn)亞洲黑熊存在的痕跡。本研究通過對(duì)車八嶺保護(hù)區(qū)發(fā)現(xiàn)的爪鞘進(jìn)行物種鑒定的結(jié)果表明，在車八嶺地區(qū)存在亞洲黑熊。同時(shí)有研究表明，通過20多年的保護(hù)實(shí)踐，車八嶺保護(hù)區(qū)生物多樣性日漸豐富，動(dòng)植物種類日漸增多，鳥類從過去的170種增加到目前的223種，其他各種野生動(dòng)植物種群數(shù)量也不斷增多［11］。黑熊的適應(yīng)能力較強(qiáng)，生態(tài)幅較寬，只要有基本的生存條件和繁殖環(huán)境，其自然種群的恢復(fù)就比較容易。由此可見，可能是因?yàn)檐嚢藥X地區(qū)森林生態(tài)環(huán)境建設(shè)不斷加強(qiáng)，引起南嶺地區(qū)黑熊種群的擴(kuò)散，使車八嶺地區(qū)亞洲黑熊的種群正在恢復(fù)。

雖然南嶺南緣的黑熊種群目前正在恢復(fù)，但對(duì)于南嶺地區(qū)黑熊資源的近況、分布、數(shù)量以及生境的變化等都不太清楚。距離上一次廣東黑熊資源專項(xiàng)調(diào)查已有10多年，有必要對(duì)廣東的黑熊資源進(jìn)行一次全面的調(diào)查，尤其是針對(duì)黑熊主要分布的南嶺地區(qū)，掌握該地區(qū)黑熊種群數(shù)量與分布，了解黑熊棲息環(huán)境的狀況和變化，對(duì)全省的黑熊資源做出比較客觀的評(píng)估，以便及時(shí)采取相應(yīng)的保護(hù)對(duì)策。以往的資源調(diào)查采用的通常是組建調(diào)查隊(duì)伍、訪問調(diào)查、現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及查閱有關(guān)的文獻(xiàn)綜合評(píng)估的方法?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查又以黑熊活動(dòng)的蹤跡，調(diào)查黑熊棲息地的自然生態(tài)環(huán)境、食物的豐富程度及組成為主，像大型貓科、熊科動(dòng)物，這種數(shù)量較少、不均勻分布、隱蔽性強(qiáng)的類群，給種群數(shù)量以及種群遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)查造成了很大困難。近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是糞便DNA分析技術(shù)的發(fā)展為這些動(dòng)物類群的調(diào)查帶來了福音，通過對(duì)糞便、毛發(fā)DNA中多種遺傳標(biāo)記的識(shí)別，研究者可以對(duì)它們的種群數(shù)量、領(lǐng)域邊界劃定、生活史、種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性等方面進(jìn)行研究［12－13］。同時(shí)，對(duì)于這些隱蔽性強(qiáng)的動(dòng)物，糞樣的系統(tǒng)收集將比利用單一的直接數(shù)量調(diào)查來評(píng)估種群數(shù)量更加準(zhǔn)確，而且能夠節(jié)省大量的人力、物力和財(cái)力［14］。

對(duì)車八嶺地區(qū)發(fā)現(xiàn)的爪鞘進(jìn)行分子鑒定，證實(shí)了目前車八嶺國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)存在黑熊。但是目前該地區(qū)黑熊的種群數(shù)量和分布的情況，是否為南嶺地區(qū)黑熊種群擴(kuò)散的結(jié)果，南嶺地區(qū)黑熊資源近況如何都不太清楚，需要進(jìn)一步對(duì)南嶺地區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)的糞便、毛發(fā)等活動(dòng)痕跡的收集，運(yùn)用一系列的不同性質(zhì)的分子標(biāo)記，對(duì)該地區(qū)的黑熊種群數(shù)量和分布展開詳細(xì)調(diào)查。

［1］汪松.中國動(dòng)物瀕危紅皮書:哺乳類［M］.北京:科學(xué)出版社，1998.

［2］馬逸清，徐利，胡錦矗.中國熊類資源數(shù)量估計(jì)及保護(hù)對(duì)策［J］.生命科學(xué)研究，1998，2(3):205.

［3］張春蘭，盧學(xué)理，袁喜才.廣東省黑熊資源及保護(hù)對(duì)策［J］.野生動(dòng)物雜志，2007，28(4):44 －46.

［4］Farrell L E，Roman J，Sunquist M E.Dietary separation of sympatric carnivores identified by molecular analysis of scats［J］.M ol Ecol，2000，9:1583 －1590.

［5］程沖，楊穎峰，孫琳琳，等.用磁珠法快速提取指甲DNA［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24(3):197 －198.

［6］Janecˇka J E，Jackson R，Zhang Yuqiang，et al.Population monitoring of snow leopards using noninvasive collection of scat samples:a pilot study［J］.Animal Conservation，2008，11(5):401 － 411.

［7］張于光，Janecka J E，李迪強(qiáng)，等.基于糞便DNA的雪豹種群調(diào)查和遺傳多樣性研究［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，54(5):762 －766.

［8］薛小琦，莫耀南.腐敗及角化組織的DNA提取及mtDNA(CA)n重復(fù)子分型［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2005，23(4):248－249.

［9］周用武，楊玉華.動(dòng)物物種鑒定的非DNA方法評(píng)述［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，30(10):58－61 .

［10］周用武.DNA技術(shù)鑒定動(dòng)物物種研究評(píng)述［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(2):48 －51.

［11］饒紀(jì)騰，宋相金，肖榮高.車八嶺自然博物館在保護(hù)區(qū)建設(shè)中地位和作用的研究［M］.廣州:嶺南美術(shù)出版社，2004.

［12］吳明，張恩迪.糞便學(xué)在有蹄類動(dòng)物數(shù)量調(diào)查研究中的應(yīng)用與展望［J］.四川動(dòng)物，2005，24(2):226 －229.

［13］王戎疆.糞便DNA分析技術(shù)在動(dòng)物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2001，47(6):699 －703.

［14］魏輔文，繞剛，李明，等.分子糞便學(xué)及其應(yīng)用:可靠性、局限性和展望［J］.獸類學(xué)報(bào)，2001，21(2):143－152.