顏 玉,鮑秀琦,薛 勇,姜 威,鄭 強,任秀英,王艷鳳

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

劃痕標(biāo)記染料示蹤實驗(serape-loading dye transfer assav,SLDT)是觀察和檢測相鄰活細胞之間 GJIC功能的重要指標(biāo)和常規(guī)方法。通過劃痕標(biāo)記染料示蹤實驗,初步篩選出對大鼠肝癌細胞 GJIC功能有較強恢復(fù)和促進作用的草蓯蓉甲醇提取物藥物終濃度,進一步進行后續(xù)實驗。劃痕標(biāo)記染料示蹤實驗是一種簡單快速研究培養(yǎng)細胞間 GJIC的方法,適用于各種培養(yǎng)細胞 ,具有方法簡單、實驗周期短、成本低廉的特點。今后在研究藥物影響細胞 GJIC功能的實驗中,可以作為初步篩選待選藥物的指標(biāo)。為臨床綜合治療腫瘤和拓展中藥的新用途提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 大鼠肝癌細胞株

大鼠肝癌細胞株 CBRH7919購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 試劑與耗材

RPMI-1640細胞培養(yǎng)液為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;0.25%含 EDTA胰酶的消化液為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為上海越研生物科技有限公司產(chǎn)品;新生牛血清為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品;青、鏈霉素溶液為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)為上海拜力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Lucifer Yellow CH和 Rhodamine B均為 Sigma公司產(chǎn)品;培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿均為德國 Greiner bio-one公司產(chǎn)品;微孔濾膜為上海亞東核級樹脂有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物

1.3.1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)。

草蓯蓉甲醇提取工藝流程:草蓯蓉干品→ZN-08型中藥粉碎機切碎→,加甲醇浸泡過夜→用布氏濾斗過濾,共提取4次,合并→ R2003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮→YC-015微型實驗室噴霧干燥機→甲醇提取物(BR)。

1.3.2 RPM I-1640培養(yǎng)液的配制:按照 GIBCO產(chǎn)品說明書進行配制,調(diào)節(jié) pH至 7.2～ 7.4,過濾除菌,分裝 ,4℃保存。用時再加入10%新生牛血清和終濃度為100U/mL青、鏈霉素溶液。

1.3.3 羅氏黃染料的配制:稱取 Lucifer Yellow CH和Rhodamine B各 5mg溶于 1mL PBS(0.01mol/L,pH7.4)中 ,作為羅氏黃染料的母液,-20℃保存。臨用時再稀釋到所需要的濃度[1]。

1.4 儀器

BNA-3210型 CO2培養(yǎng)箱 (日本 Espec);超凈工作臺 (蘇州凈化設(shè)備廠);3169型倒置顯微鏡 (重慶 COIC);熒光倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Olympus);細胞計數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司);ALG 1104型電子天平(日本島津);CDBER SCAN 510型 pH儀 (意大利 Hanna);Nex Power 1000型純水器(韓國 Human Corp);YDS-30液氮器(四川省樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司公司);XY J-801型電動離心機(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠 );JB-1型攪拌器(上海雷磁儀器廠新徑分廠);BCD-215KANDZ電冰箱(青島海爾股份有限公司);Haier冰柜 (青島海爾特種電冰柜有限公司);YX280B手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);電熱恒溫干燥箱(長沙醫(yī)療器械廠)。

2 方法

2.1 細胞消化、計數(shù)、鋪板及培養(yǎng)

倒置顯微鏡觀察,待傳代培養(yǎng)的大鼠肝癌細胞生長融合率達90%以上時,吸盡細胞培養(yǎng)液,用 PBS(0.01mol/L,pH7.4)沖洗細胞 2～ 3次;滴加適量含0.25%EDTA的胰酶消化細胞,倒置顯微鏡觀察,待細胞大部分變圓之時,吸去胰酶,加入適量 RPM I-1640培養(yǎng)液終止消化;用吸管輕輕吹打貼壁的細胞數(shù)次,倒置顯微鏡觀察細胞大部分脫落懸浮后,將細胞懸液吸取至試管中,以1500r/min離心5min;棄上清,加入適量 RPMI-1640培養(yǎng)液,吹打混勻細胞;用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞,把大鼠肝癌細胞按每孔 5×105個細胞接種到30mm的培養(yǎng)皿中,加入 RPMI-1640培養(yǎng)液至總體積 2mL,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)[2]。

2.2 細胞分組及藥物處理

大鼠肝癌細胞培養(yǎng)24h后,將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出,吸棄每皿上清,每皿按總體積為2mL進行培養(yǎng)。大鼠肝癌細胞隨機分為 5個組:分別為1個對照組、4個實驗組。4個實驗組加入草蓯蓉甲醇提取物,使藥物終濃度分別達到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L;對照組加入與最高濃度藥物等體積的 DMSO,加藥后每皿體積不足2mL者,加入 RPMI-1640培養(yǎng)液總體積 2mL。置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h[3]。

2.3 測定指標(biāo)和方法

大鼠肝癌細胞加藥培養(yǎng)48h后,待培養(yǎng)皿中的大鼠肝癌細胞單層鋪滿培養(yǎng)皿底,按如下步驟操作:

(1)吸棄培養(yǎng)液后用預(yù)熱 37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)輕輕沖洗 3遍,以除去細胞表面的雜質(zhì);

(2)用手術(shù)刀片在皿底輕輕劃痕5道,然后加入0.1%羅氏黃染液 lmL,避光37℃孵育5min;

(3)吸凈染液,用預(yù)熱 37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)漂洗3遍并吸凈,以除去游離的剩余熒光染料;

(4)每皿加預(yù)熱37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)1mL,以防觀察過程中細胞干涸、變形、死亡,于熒光倒置顯微鏡下觀察并攝片。

熒光染料羅氏黃通過縫隙連接傳遞,在藍色激發(fā)光下顯綠色熒光,當(dāng)細胞同時被染上綠色和紅色時,說明這細胞是不是通過縫隙連接傳遞的,而是被熒光染料羅氏黃和羅丹明共同染色的凋亡或壞死的細胞,結(jié)果統(tǒng)計時應(yīng)除外。通過觀察 LY自傷沿列細胞向相鄰細胞傳遞的距離進行半定量檢測來評價細胞縫隙連接通訊功能的狀態(tài)[4]。

結(jié)果判讀:選擇劃痕較平滑處計數(shù)帶有熒光的細胞層數(shù),(-)熒光僅限于自傷沿單列(即熒光只出現(xiàn)在劃痕旁 1列細胞中);(+)熒光自傷沿列細胞傳遞至鄰近的一列細胞內(nèi)(即熒光只出現(xiàn)在劃痕旁 2列細胞中);(? )熒光自傷沿列細胞傳遞至鄰近的兩列細胞內(nèi)(即熒光只出現(xiàn)在劃痕旁3列細胞中);(?)熒光自傷沿列細胞傳遞至鄰近的三列細胞內(nèi) (即熒光只出現(xiàn)在劃痕旁4列細胞中);()熒光自傷沿列細胞傳遞至鄰近的四列細胞或更遠距離。

3 結(jié)果

熒光染料劃痕負載5min后,于倒置熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示(表1),空白對照組細胞的熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕旁1列細胞中,半定量為(±),熒光亮度低,細胞間染料傳輸功能差;與空白對照組細胞相比,細胞經(jīng)草蓯蓉甲醇提取物(BR)0.5g/L作用48h后的大鼠肝癌細胞中,熒光染料出現(xiàn)在劃痕附近至劃痕旁的2～ 3列細胞內(nèi),半定量為(),熒光亮度增加,細胞間染料傳輸功能增強;細胞經(jīng)草蓯蓉甲醇提取物(BR)0.75g/L、1.0g/L作用48h后的細胞中,熒光染料出現(xiàn)在劃痕的附近細胞內(nèi)至劃痕以外的 5～ 6列甚至 7～ 8列細胞內(nèi),半定量為(),形成連片狀的熒光染色,熒光亮度明顯增加,細胞間染料傳輸功能顯著增強;細胞經(jīng)草蓯蓉甲醇提取物 (BR)0.25g/作用48h后的細胞中,熒光染料出現(xiàn)在劃痕附近至劃痕旁的1～ 2列細胞內(nèi),半定量為 (+ ),熒光亮度稍增加,細胞間染料傳輸輕微增強。

表1 草蓯蓉甲醇提取物(BR)對大鼠肝癌細胞 GJIC功能的影響

4 討論

本實驗采用草蓯蓉甲醇提取物,使藥物終濃度分別達到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L對大鼠肝癌細胞生長有抑制作用的濃度對大鼠肝癌細胞 GJIC影響的研究。實驗結(jié)果顯示,空白對照組細胞的熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕旁1～2列細胞中而且亮度低,細胞間染料傳輸功能差,說明細胞之間的 GJIC功能喪失或降低;經(jīng)草蓯蓉甲醇提取物0.5g/L作用48h后的細胞中,熒光染料出現(xiàn)在劃痕附近至劃痕旁的1～ 3列細胞內(nèi),熒光亮度輕微增加,細胞間染料傳輸輕微增強。經(jīng)草蓯蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L作用48h后的細胞中,熒光染料不僅出現(xiàn)在劃痕的附近細胞內(nèi),而且在劃痕以外的5～ 6列甚至 7～ 8列細胞內(nèi)也出現(xiàn)了明顯的熒光。以上研究結(jié)果表明,在選取的草蓯蓉甲醇提取物,使藥物終濃度分別達到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L分別作用于大鼠肝癌細胞48h后,與空白對照組相比,草蓯蓉甲醇提取物0.5g/L更能顯著增加細胞間染料傳輸功能。其機制可能為:大鼠肝癌細胞 GJIC狀態(tài)差,細胞間正常的連接無法維持,熒光染料傳遞范圍小,而草蓯蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L作用于大鼠肝癌細胞后,在一定程度上恢復(fù)和促進了細胞的GJIC功能,重新建立細胞間連接,細胞間染料傳輸功能顯著增加;而草蓯蓉甲醇提取物0.25g/L對大鼠肝癌細胞 GJIC功能恢復(fù)和促進作用弱,因而細胞間染料傳輸功能弱。通過劃痕標(biāo)記染料示蹤實驗,初步篩選出草蓯蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L對細胞 GJIC功能有較強恢復(fù)和促進作用,進一步進行后續(xù)實驗。劃痕標(biāo)記染料示蹤實驗是一種簡單快速研究培養(yǎng)細胞間 GJIC的方法,適用于各種培養(yǎng)細胞 ,具有方法簡單、實驗周期短、成本低廉的特點。今后在研究藥物影響細胞 GJIC功能的實驗中,可以作為初步篩選待選藥物的指標(biāo)。

[1] EL-Fouly M H,Trosko JE,Chang CC.Scrape-loading and dye transfer:a rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication[J].Exp Cell Res,1987,168:422-430

[2] Melet A,Song K,Bucur O,et al.Apoptotic pathways in tumor progression and therapy[J].Adv Exp Med Biol,2008,615:47-79

[3] 楚玉南,戴續(xù)紅,吳華新.草蓯蓉生物學(xué)特性初探 [J].中國林副特產(chǎn),2009,3:104

[4] 高德宗.Fas系統(tǒng)與腫瘤治療 [J].國外醫(yī)學(xué) (腫瘤學(xué)分冊),2005,32(5):368-371