張 麗

（廣州市花都區(qū)慢性病防治所，廣東 廣州 510800）

肺結(jié)核患者由于病程較長(zhǎng)，長(zhǎng)期的慢性消耗導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下，肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞，特別是病情較重的結(jié)核患者,往往由于肺部結(jié)核病變廣泛，存在干酪樣壞死和空洞等，使局部抵抗力降低，容易受到各種致病因子的侵襲，加上某些病例合并有糖尿病或其他疾病長(zhǎng)期應(yīng)用皮質(zhì)激素等免疫抑制劑，使機(jī)體的抵抗力更為下降。因此結(jié)核患者合并真菌感染的狀況日益增多，其中呼吸系統(tǒng)真菌感染占首位[1]。從2005年1月至2010年12月我單位收治肺結(jié)核患者3 049例，其中80例肺結(jié)核患者合并真菌感染。為探討肺結(jié)核繼發(fā)真菌感染患者分離真菌的基因鑒定及其類型，本文對(duì)80例肺結(jié)核患者呼吸道分泌物分離的99株真菌進(jìn)行了生物學(xué)研究和基因鑒定及其分型，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 肺結(jié)核合并真菌感染的患者80例，其中男性58例，女性22例，年齡18～63歲，平均47.8歲，X線檢查和痰涂片(+)。所有病例痰連續(xù)3次培養(yǎng)均有酵母菌或霉菌生長(zhǎng)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 Chrom培養(yǎng)基由上?？片敿挝⑸镉邢薰咎峁?，微量生化反應(yīng)管與試劑由杭州天和微生物試劑公司提供，白假絲酵母菌A型標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 64550由樂通泰生物科技有限公司提供，ITS引物序列由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供，白假絲酵母菌分型引物由上海生工公司合成，Taq酶、dN TP采用寶生物公司預(yù)混PCR試劑盒，Lyitcase細(xì)胞溶解酶由上海易佰聚有生物有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 真菌分離與鑒定 以咳痰法或氣管插管吸引法采集患者下呼吸道分泌物標(biāo)本[2]，接種于沙氏培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48～72 h后，進(jìn)行涂片革蘭染色鏡檢，凡假絲酵母菌劃線接種于Chrom瓊脂平板，置普通溫箱內(nèi)28℃培養(yǎng)48～72 h，凡培養(yǎng)基上呈優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的菌落判斷為引起感染的病原菌，再進(jìn)一步鑒定[3]。

1.3.2 常規(guī)方法鑒定 各分離菌株分別進(jìn)行形態(tài)或/和生化反應(yīng)鑒定。假絲酵母菌根據(jù)在Chrom培養(yǎng)基生長(zhǎng)菌落的顏色、芽管試驗(yàn)、厚膜孢子形成試驗(yàn)、糖發(fā)酵及糖同化試驗(yàn)結(jié)果鑒定其菌種；霉菌根據(jù)菌落培養(yǎng)和形態(tài)特征以及鏡下孢子和菌絲特點(diǎn)鑒定其菌種。

1.3.3 ITS檢測(cè)與鑒定(真菌種間分型)

1.3.3.1 真菌基因組DNA的抽提 菌液離心后，用1 mol/L的山梨醇洗一次，用酵母用溶細(xì)胞酶[Lyticase(Sigma)]消化，獲取原生質(zhì)體。用10 g/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解，苯酚氯仿混合提取法提取DNA[4]。

1.3.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 引物序列ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，19 mer；ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'，20 mer。 引 物稀釋：用TE緩沖液稀釋引物，終濃度為10 μmol/L。

1.3.3.3 PCR擴(kuò)增 78株酵母菌與21株霉菌分別進(jìn)行ITS序列的PCR擴(kuò)增，條件與步驟為：反應(yīng)體系總體積為50 μl，包括10×PCR 緩沖液5 μl，200 μmol/L dNTP，2 U Taq酶，引物 ITS1 和ITS2 各2 μl，蒸餾水補(bǔ)至50 μl。PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，而后72℃保持3 min延伸。

1.3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析 采用瓊脂糖凝膠電泳法。PCR 產(chǎn)物5 μl與溴化乙啶2 μl混合，電泳緩沖液TBE，電壓140 V，在含0.5 μg/ml溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，以50 bp、100 bp DNA梯型為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)果在紫外燈下觀察。

1.4 白假絲酵母菌基因型分析 引物合成采用特異引物擴(kuò)增白假絲酵母菌基因組DNA的25 S rDNA基因的內(nèi)含子區(qū)，以內(nèi)含子大小約379 bp及其中可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子片段的缺失或插入作為分型依據(jù)。一對(duì)分型引物P1、P2分別位于可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子的兩翼[5]。P1：5'-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATA GATCCGTAA-3'(上游引物)，30 mer，P2：5'-CCTTGG CTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3'(下游引物)，30 mer。引物稀釋：用TE緩沖液稀釋引物至終濃度為10 μmol/L。PCR擴(kuò)增方法如1.3.3.3。

2 結(jié) 果

2.1 病原性真菌種間分型結(jié)果 99株真菌的ITS序列鑒定結(jié)果及其與生物學(xué)鑒定的關(guān)系：酵母菌78株，符合率為83.3%；霉菌21株，符合率為71.4%；總符合率為80.8%，見表1和圖1。

表1 肺結(jié)核合并真菌感染患者病原性真菌的ITS鑒定結(jié)果(株)

圖1 病原性真菌的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 病原性真菌的基因型 以P1、P2為引物，以白假絲酵母菌臨床分離株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳圖譜，插入的可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子片段大小約379 bp。49株白假絲酵母菌經(jīng)25S rDNAⅠ型內(nèi)含子基因鑒定分為3型，包括基因A型21株(40.8%)、基因B型14株(28.5%)以及基因C型15株(30.6%)，未發(fā)現(xiàn)基因D型與基因E型菌株(圖2)。PCR分型實(shí)驗(yàn)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，條帶清晰，條帶大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 白假絲酵母菌25S rDNAⅠ型內(nèi)含子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

肺結(jié)核是一種慢性消耗性疾病，患者病程較長(zhǎng)，肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞，呼吸系統(tǒng)防御功能降低，易患二重感染，尤其是合并真菌感染。真菌的檢測(cè)目前主要依靠常規(guī)直接鏡檢或培養(yǎng)。直接鏡檢操作簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用，但檢測(cè)陽(yáng)性率較低，陰性結(jié)果不能排除感染，需與培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)合使用，培養(yǎng)時(shí)間需2～3 d，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢出率低。近年來檢測(cè)真菌循環(huán)抗原(抗體)、特異性酶和代謝產(chǎn)物的血清學(xué)方法則存在特異性和敏感性低的缺陷。分子生物學(xué)的的出現(xiàn)使得真菌的檢測(cè)技術(shù)得到了很大發(fā)展，不僅能檢測(cè)出活的致病菌，而且能檢測(cè)出死亡的和難以培養(yǎng)的真菌[3]。

隨著真菌學(xué)研究的不斷深入，許多病原真菌的基因組序列已探明。根據(jù)這些已知序列可以選擇其保守區(qū)域設(shè)計(jì)具有種、屬特異性的引物用于醫(yī)學(xué)真菌的檢測(cè)。真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal tran scribed spacer region，ITS)是位于真菌核糖體DNA(rDNA)上18S和28S基因之間的區(qū)域片段，該區(qū)域進(jìn)化較快，具有一定的種間特異性和種內(nèi)保守性，可將假絲酵母菌鑒定到種、亞種[5-6]。本課題結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，傳統(tǒng)生物學(xué)方法能夠正確地鑒定絕大多數(shù)病原性真菌的菌種，而檢測(cè)ITS序列則有利于真菌感染的快速診斷和提高真菌鑒定的準(zhǔn)確率以及基因型分析與研究。本方法與傳統(tǒng)分型方法和其他分子生物學(xué)方法相比，具有快速、簡(jiǎn)捷、可靠的優(yōu)點(diǎn)。PCR基因分型方法具有快速、簡(jiǎn)捷、可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)從模板DNA提取到PCR擴(kuò)增后電泳觀察結(jié)果，共耗時(shí)7 h左右，可在一個(gè)工作日內(nèi)完成，比較適合臨床真菌菌種內(nèi)和種間分型研究。本課題應(yīng)用靈敏特異的PCR分型方法，采用真菌通用引物ITS1、ITS2擴(kuò)增念珠菌中18、518S rDNA基因的小段片段及其之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1，利用其擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小不同將13種常見真菌鑒定出來。99株真菌的ITS序列鑒定結(jié)果及其與生物學(xué)鑒定的關(guān)系：酵母菌78株，符合率為72.4%；霉菌21株，符合率為85.7%；總符合率為84.8%。白假絲酵母菌在25S rDNA編碼區(qū)內(nèi)存在一可轉(zhuǎn)座Ⅰ型內(nèi)含子核苷酸序列，根據(jù)內(nèi)含子缺失以及形成的片段大小，可將白假絲酵母菌分為A、B、C、D、E五個(gè)基因型[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者郭新美等[8]報(bào)道，在74例肺結(jié)核繼發(fā)真菌感染病例中以假絲菌居多，其中白假絲菌為主，占70.3%；光滑假絲菌占12.2%；熱帶假絲菌占6.8%；另外還有少數(shù)隱球菌、曲霉菌、毛霉菌。陳素麗等[9]報(bào)道也是以假絲菌屬居多，其中白假絲菌占51.5%，光滑假絲菌占19.9%，熱帶假絲菌占11.8%，曲霉菌占8.1%，毛霉菌占1.5%。本研究結(jié)果顯示檢出99株真菌中以白假絲酵母菌為主。49株白假絲酵母菌經(jīng)25S rDNAⅠ型內(nèi)含子基因鑒定分為3型，包括基因A型21株(40.8%)、基因B型14株(28.5%)以及基因C型15株(30.6%)，未發(fā)現(xiàn)基因D型與基因E型菌株?；駻型、B型和C型是常見的病原性白假絲酵母菌，其中以基因A型的檢出率最高。提示花都區(qū)肺結(jié)核合并真菌患者的病原性白假絲酵母菌也同樣以基因A型、B型和C型常見，但基因A型占明顯多數(shù)。本研究探討花都區(qū)肺結(jié)核患者合并真菌感染情況以及病原性真菌常見種類、分布及基因型，實(shí)驗(yàn)證明檢測(cè)ITS序列和25S rDNAⅠ型內(nèi)含子序列有助于真菌感染的快速基因診斷和提高菌種鑒定的準(zhǔn)確率。用于控制醫(yī)院內(nèi)感染和預(yù)防肺結(jié)核患者合并真菌感染，對(duì)肺結(jié)核合并真菌感染患者的治療和預(yù)防具有重要的臨床意義。

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