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柱后衍生化高效液相色譜法測定門冬氨酸鳥氨酸顆粒劑的有關(guān)物質(zhì)及含量*

2011-06-21 06:18覃婷婷韓曉捷黃哲甦
天津藥學 2011年5期
關(guān)鍵詞:鳥氨酸內(nèi)酰胺氨酸

覃婷婷,韓曉捷,黃哲甦

(天津市藥品檢驗所,天津 300070)

門冬氨酸鳥氨酸顆粒在臨床上適用于急、慢性肝病包括肝硬化、脂肪肝、各型病毒性和中毒性肝炎以及高血氨癥,特別是因肝臟疾病所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的改善及肝性腦病的救治[1]。門冬氨酸鳥氨酸本身紫外吸收較弱,其含量通常采用氨基柱HPLC法通過末端吸收測定[2],或是采用柱前衍生HPLC法[3]測定,這兩種方法對于制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢查均不太適合,前者靈敏度較差,后者衍生試劑干擾較大,且衍生后產(chǎn)物不穩(wěn)定,影響準確性?!兜聡幍洹?008年版對收載的門冬氨酸鳥氨酸原料規(guī)定用TLC法檢查有關(guān)物質(zhì),但是該方法靈敏度不高,無法準確定量。鑒于此,本文嘗試建立了柱后衍生的方法測定門冬氨酸鳥氨酸的有關(guān)物質(zhì),一方面將提高響應(yīng)值,另一方面,由于柱后衍生反應(yīng)時間較短,減少了過多雜質(zhì)的生成,且消除了衍生試劑的干擾,故而具有方便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

1 儀器與試藥

LC-2010AHT系列液相色譜儀(日本Shimadzu公司),PINNACLE PCX柱后衍生儀(Pickering公司);門冬氨酸鳥氨酸顆粒(國外某企業(yè),批號005271、612111、709811);對照品:門冬氨酸、鹽酸鳥氨酸、鹽酸鳥氨酸內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥氨酸(國外某企業(yè),批號分別為BCBC7841、035K05791、ED 12/07、1352773、ED 05/04);辛烷磺酸鈉為HPLC專用試劑(山東禹王);乙腈為色譜純(天津康科得);鄰苯二甲醛(J&K公司);巰基丙酸(Alfa Aesar);其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1有關(guān)物質(zhì)檢查方法

2.1.1色譜條件 色譜柱:Synergi Hydro RP(150 mm×3 mm, 4 μm);流動相A:取1.08 g辛烷磺酸鈉溶于1 000 ml水中,加1.6 ml高氯酸;流動相B:取1.08 g辛烷磺酸鈉溶于500 ml水中,加500 ml乙腈混勻,再加1.6 ml高氯酸,采用梯度程序洗脫,見表1;流速1.0 ml/min,檢測波長336 nm,柱溫35 ℃,進樣量20 μl。衍生條件溫度80 ℃,衍生試劑流速0.6 ml/min。

表1 有關(guān)物質(zhì)程序洗脫條件

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1供試品溶液的制備 取本品適量,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門冬氨酸鳥氨酸1.5 mg的溶液,作為供試品溶液。

2.1.2.2對照品溶液的制備 分別稱取門冬氨酸和鹽酸鳥氨酸對照品適量,精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門冬氨酸和鳥氨酸7.5 μg的溶液,搖勻,作為對照品溶液。

2.1.2.3系統(tǒng)適用性溶液的制備 分別稱取門冬氨酸、鹽酸鳥氨酸、鹽酸鳥氨酸內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥氨酸對照品適量,精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中分別含門冬氨酸和鳥氨酸0.75 mg,含鳥氨酰內(nèi)酰胺、賴氨酸和Ω-二鳥氨酸7.5 μg的溶液,搖勻,作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.1.2.4陰性對照溶液的制備 按處方制備不含門冬氨酸鳥氨酸的陰性樣品,并按供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.1.3系統(tǒng)適用性試驗 取系統(tǒng)適用性溶液,進樣20 μl,記錄色譜圖。結(jié)果表明,在該色譜條件下門冬氨酸、鳥氨酸與3種雜質(zhì)分離度均大于1.5,陰性對照在主成分和雜質(zhì)相應(yīng)的保留時間處無干擾。各峰的分離度和保留時間見表2,典型分離圖見圖1。

2.1.4線性考查 精密稱取門冬氨酸和鹽酸鳥氨酸對照品適量,用0.1 mol/L鹽酸溶液配成相當于有關(guān)物質(zhì)檢查用對照品溶液的50%、80%、100%、120%和150%濃度的5種溶液,各取20 μl分別注入液相色譜儀,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標得到線性方程。門冬氨酸回歸方程為:Y= 42 005X-22 901(r=0.999 6),鳥氨酸回歸方程為:Y= 78 041X-38 513(r= 0.999 8)。結(jié)果表明,在3.75~11.25 μg/ml范圍內(nèi)門冬氨酸與鳥氨酸溶液濃度均與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.門冬氨酸 2.鳥氨酸 3.鳥氨酸內(nèi)酰胺 4.賴氨酸 5.Ω-二鳥氨酸

2.1.5校正因子的測定 精密稱取鹽酸鳥氨酸和鹽酸鳥氨酸內(nèi)酰胺對照品適量,用0.1 mol/L鹽酸溶液配成每1 ml各分別含4、6、8、10和12 μg的5種溶液,取20 μl分別注入液相色譜儀,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標得到線性方程,以鳥氨酸與鳥氨酸內(nèi)酰胺的斜率之比作為鳥氨酸內(nèi)酰胺雜質(zhì)的校正因子,測得結(jié)果為1.851 9。

2.1.6檢出限 取“2.1.4”項下的100%濃度溶液,用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋制備不同濃度的溶液,在選定的色譜條件下,按信噪比為3對最低檢測量進行測定。結(jié)果表明,門冬氨酸和鳥氨酸的檢出限均為5 ng。

2.1.7溶液的穩(wěn)定性 取配制后的供試品溶液分別于0、2、4和8 h進樣,測定峰面積。結(jié)果表明,放置4 h后,鳥氨酸內(nèi)酰胺和未知雜質(zhì)峰峰面積隨放置時間而增高,表明該溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8有關(guān)物質(zhì)測定 取本品3批(批號005271、612111、709811)分別按“2.1.2”項下的方法制備對照品溶液和供試品溶液,進樣20 μl,記錄色譜圖,按外標法加校正因子以峰面積計算,鳥氨酸內(nèi)酰胺含量按鳥氨酸峰面積計算分別為0.06%、0.08%和0.05%,其他未知雜質(zhì)的含量,按門冬氨酸峰計算分別為0.09%、0.05%和0。

2.2含量測定方法

2.2.1色譜條件 同“2.1.1”項下色譜條件,程序洗脫條件見表3。

表3 含量測定程序洗脫條件

2.2.2溶液配制

2.2.2.1對照品溶液 分別稱取門冬氨酸和鹽酸鳥氨酸對照品適量,精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門冬氨酸和鳥氨酸0.075 mg的溶液,搖勻,即得。

2.2.2.2供試品溶液 取本品10包,研細后精密稱定,加0.1 mol/L鹽酸溶液制成每1 ml中含門冬氨酸鳥氨酸0.15 mg的溶液,搖勻,即得。

2.2.2.3陰性對照溶液的制備 按處方制備不含門冬氨酸鳥氨酸的陰性樣品,并按供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.2.3專屬性試驗 按“2.2.1”項下色譜條件,分別精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl進樣分析。結(jié)果表明,對照品溶液中門冬氨酸和鳥氨酸分別在3 min和15.5 min左右出峰,而供試品溶液在相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn),陰性對照溶液在此處無峰,表明處方中其他成分對主成分含量的測定無干擾,見圖2。

2.2.4線性考查 考查了相當于含量測定用對照品溶液的50%~150%范圍內(nèi)的線性關(guān)系。門冬氨酸回歸方程為:Y= 37 184X- 2 606(r=0.999 8);鳥氨酸回歸方程為:Y= 78 062X- 108 174(r=0.999 9)。結(jié)果表明,在37.5~112.5 μg/ml范圍內(nèi)門冬氨酸和鳥氨酸溶液濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

1.門冬氨酸 2.鳥氨酸

2.2.5回收率試驗 分別取門冬氨酸對照品60、75和90 mg和鹽酸鳥氨酸對照品75、96和115 mg各3份,精密稱定,分別置100 ml量瓶中,按處方量分別加入輔料,用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度,再精密量取1 ml至10 ml量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,依法測定并計算門冬氨酸和鳥氨酸的回收率,門冬氨酸回收率(n=9)為101.2%,RSD為0.92%;鳥氨酸回收率(n=9)為101.0%,RSD為0.97%。結(jié)果見表4。

2.2.6重復性考查 取同一批樣品,同法制備6份供試品溶液,分別測定含量,其平均含量為102.1%,RSD為0.41%,表明方法的重復性良好。

2.2.7供試品溶液的穩(wěn)定性 取配制后的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12和24 h進樣,測定峰面積。門冬氨酸峰面積RSD為0.94%(n=8),鳥氨酸峰面積RSD為0.76%(n=8),結(jié)果表明,供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8含量測定 取“2.2.2”項下的對照品溶液和供試品溶液各20 μl進樣,按外標法以峰面積計算樣品含量。結(jié)果3批樣品(批號005271、612111、709811)的含量為102.5%、96.8%和98.9%,均符合規(guī)定。

表4 門冬氨酸和鳥氨酸回收率試驗結(jié)果

3 討論

3.1色譜柱的選擇 在實驗過程中曾分別試驗過Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,)、Agilent SB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)等常規(guī)規(guī)格的色譜柱,但分離效能均沒有Synergi Hydro RP(150 mm×3 mm, 4 μm)色譜柱效果好。但是該柱因為內(nèi)徑小,所以柱壓高,會縮短色譜柱壽命,并且不易獲得,因此在滿足分離條件的前提下可以考慮用常規(guī)色譜柱代替。

3.2關(guān)于有關(guān)物質(zhì)檢查方法的建議 考慮到雜質(zhì)對照品較難獲得,采用加校正因子的主成分對照品外標法來測定已知雜質(zhì),可減少雜質(zhì)對照品的使用量,盡量降低分析的成本。

3.3關(guān)于含量測定計算的討論 門冬氨酸鳥氨酸衍生后經(jīng)色譜柱分離為門冬氨酸和鳥氨酸兩個峰,在以前有的計算方法是將二者的峰面積加和計算的,筆者在本實驗中是分別計算出門冬氨酸和鳥氨酸的含量后,再分別折合成門冬氨酸鳥氨酸的含量,然后取二者的平均值作為測定的結(jié)果。建議折合后的含量應(yīng)計算相對平均偏差(RAD),將其控制在2%以內(nèi),以此保證樣品中門冬氨酸與鳥氨酸的摩爾比接近理論值1∶1,使結(jié)果更加準確。

本法與薄層色譜法、柱前衍生化HPLC法比較,具有靈敏度高、準確檢測制劑中雜質(zhì)、結(jié)果準確等優(yōu)點,適用于測定門冬氨酸鳥氨酸顆粒劑中的有關(guān)物質(zhì)及含量。

1 蔣音, 陳良, 巫善明. 門冬氨酸鳥氨酸的藥理作用與臨床應(yīng)用. 世界感染雜志, 2007, 7(5): 415

2 繆寧梅, 馬婕. 高效液相色譜法測定門冬氨酸鳥氨酸注射液的含量. 中國生化藥物雜志, 2007, 28(1): 52

3 張莉, 黃哲蘇, 李海生. 異硫氰酸苯酯柱前衍生法測定門冬氨酸鳥氨酸注射液含量. 藥物分析雜志, 2008, 28(7): 1174

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