陳少華，耿 鵬，胡美英，肖 盈，劉明智

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642)

擬除蟲菊酯(Pyrethroids)農(nóng)藥是20世紀(jì)70年代在農(nóng)業(yè)上推廣應(yīng)用的一類仿生殺蟲劑，它以神經(jīng)鈉離子通道為作用靶標(biāo)，具有高效、低毒等特點(diǎn)，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)作物害蟲及家庭衛(wèi)生害蟲［1］.目前其品種數(shù)和使用量僅次于有機(jī)磷農(nóng)藥，位居殺蟲劑市場的第2位，約占世界農(nóng)藥市場的1/4，在我國的使用面積已占?xì)⑾x劑總施用面積的1/3以上［2］.其中，高效氯氰菊酯和氰戊菊酯是最常用的菊酯農(nóng)藥品種，占該類農(nóng)藥市場的1/2以上［3］.大量研究表明，這2種菊酯農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性［4］、生殖毒性［5-6］和蓄積毒性，長期接觸可誘發(fā)一些慢性疾?。?］，甚至有致癌、致畸、致突變的危險(xiǎn)［8］.因此，聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界貿(mào)易組織(WTO)對高效氯氰菊酯和氰戊菊酯在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留作出嚴(yán)格的限量規(guī)定，歐盟、美國、日本等發(fā)達(dá)地區(qū)和國家相應(yīng)的要求更為嚴(yán)格［9］.

利用微生物降解劑處理農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，已越來越受到人們的重視［10］.筆者從長期生產(chǎn)擬除蟲菊酯農(nóng)藥的化工廠活性污泥中分離獲得1株菊酯農(nóng)藥高效降解菌Stenotrophomonas sp.ZS-S-01，該菌株不僅對高效氯氰菊酯和氰戊菊酯等菊酯農(nóng)藥具有較高的降解效果，對其降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸也具有明顯的去除作用，具備較好的研究開發(fā)潛力［11］.本試驗(yàn)研究降解菌株ZS-S-01處理對菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯農(nóng)藥殘留動態(tài)的影響，為今后開發(fā)菊酯農(nóng)藥殘留生物降解菌劑提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 供試菌種為Stenotrophomonas sp.ZS-S-01(以下簡稱ZS-S-01)，系作者從長期生產(chǎn)擬除蟲菊酯農(nóng)藥的廢水排放口的活性污泥中分離獲得，并已獲得中國典型培養(yǎng)物保藏中心菌種專利保藏(保藏號為CCTCC M 2010095).

1.1.2 蔬菜 供試蔬菜為碧綠油菜心Brassica campestris L.，種子購自蔡興利國際有限公司.室內(nèi)盆栽試驗(yàn)和田間小區(qū)試驗(yàn)均為4～5葉期，生長期間不噴灑任何農(nóng)藥.

1.1.3 主要試劑和儀器 4.5%高效氯氰菊酯乳油和20%氰戊菊酯乳油，分別購自中山凱達(dá)精細(xì)化工股份有限公司和杭州慶豐農(nóng)化有限公司.94.8%高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品和91.2%氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品由中山凱達(dá)精細(xì)化工股份有限公司提供.其他均為國產(chǎn)常規(guī)分析純試劑.

主要儀器包括:HR-250A生化培養(yǎng)箱(常州國華電器有限公司)、SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)、TDL-5000B低溫冷凍多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、KQ-500M超聲波清洗儀(東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司)、LABORTA-4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph，德國)、Agilent 6890N氣相色譜儀(Agilent，美國)等.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藥添加回收率的測定 將高效氯氰菊酯和氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮分別配制成1、10和100 mg/L 3種梯度的標(biāo)樣，然后各標(biāo)樣取2.5 mL分別加到25 g已研磨粉碎的無污染新鮮菜心中，每個(gè)處理重復(fù)3次，設(shè)加等量清水的處理為對照(即以上2種菊酯農(nóng)藥在菜心中的終質(zhì)量濃度為0.1、1.0和10.0 mg/kg).

擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量的測定方法參照文獻(xiàn)［12］，略有改進(jìn):每個(gè)重復(fù)(25 g)分別加入丙酮和石油醚各25 mL于250 mL具塞三角瓶中，150 r/min振蕩提取1 h，靜置分層后取上清液5 mL過凈化柱(中性氧化鋁小柱)，用60 mL石油醚分3次淋洗小柱，將所得濾液收集于250 mL圓底燒瓶中，50℃減壓濃縮，最后用石油醚定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，使用Agilent 6890N氣相色譜儀檢測各菊酯農(nóng)藥的殘留量.

1.2.2 目標(biāo)菌株的室內(nèi)盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)間為2009年10月，天氣多云為主，日均溫26℃左右.以4～5葉期的菜心為供試植物，2種菊酯農(nóng)藥按照推薦使用濃度均勻噴灑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并以噴灑等量清水為對照.噴灑1 d后接種，噴菌量為每株5 mL(1.0 ×107CFU/mL).分別在 0、12、24、36、48、60和72 h取樣，按5點(diǎn)取樣法，采集菜心樣品于自封袋中，置于-20℃低溫保存，待測.

1.2.3 目標(biāo)菌株的田間小區(qū)試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)間為2009年10月，天氣多云為主，日均溫26℃左右.試驗(yàn)地點(diǎn)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場.以4～5葉期的菜心為供試植物，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，3個(gè)對照小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為1.5 m×1.5 m，小區(qū)間隔0.5 m×0.5 m，處理和對照小區(qū)相間排列.噴藥量、噴菌量同室內(nèi)盆栽試驗(yàn).試驗(yàn)期間無雨，否則試驗(yàn)視為無效.采樣時(shí)間、采樣方法、貯存方法及測定方法同1.2.2.

1.2.4 樣品的氣相色譜檢測 擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量的氣相色譜(GC)檢測參照文獻(xiàn)［13］，有改進(jìn):Agilent 6890N氣相色譜，HP-1701毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm ×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度:250 ℃;檢測器(ECD)溫度:320℃;柱溫采用程序升溫:初溫160℃，保持5 min，以10℃/min升溫至200℃，保持1 min，再以10℃/min升溫至280℃，保持25 min;載氣:氮?dú)?，純度?9.999%，流速3 mL/min，不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量為 1 μL.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 顯著性分析檢驗(yàn)以DPS7.05(Data processing system version 7.05)統(tǒng)計(jì)軟件分析求取.降解動力學(xué)分析采用一級降解動力學(xué)模型［14］:Ct=C0×e-kt，其中，Ct為t時(shí)刻擬除蟲菊酯農(nóng)藥的殘留量(計(jì)量單位為mg·kg-1);C0為擬除蟲菊酯農(nóng)藥的初始濃度(計(jì)量單位為mg·kg-1);k為降解速率常數(shù)(計(jì)量單位為h-1).擬除蟲菊酯農(nóng)藥降解半衰期(T1/2)通過下列公式計(jì)算:T1/2=ln2/k.降解率的計(jì)算方法［15］:

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氰菊酯和氰戊菊酯標(biāo)樣氣相色譜測定結(jié)果

在1.2.4所述氣相色譜測定條件下，高效氯氰菊酯和氰戊菊酯存在順反異構(gòu)體，故峰形由2個(gè)峰組成，且峰形尖銳、穩(wěn)定(圖1).從圖1、圖2可見，高效氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間分別為30.264和30.698 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.0×107x+733 621，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0;氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間為34.337和35.742 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.0×107x+5.0×107，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1.從以上2種藥劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)可以看出，供試藥劑濃度與其對應(yīng)的峰面積相關(guān)性顯著，檢測方法可信.

圖1 高效氯氰菊酯(a)和氰戊菊酯(b)標(biāo)準(zhǔn)樣品(10 mg/L)氣相色譜圖Fig.1 GC chromatograms of β-cypermethrin(a)and fenvalerate(b)(10 mg/L)

圖2 高效氯氰菊酯(a)和氰戊菊酯(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curves of β-cypermethrin(a)and fenvalerate(b)

2.2 添加回收率測定結(jié)果

在1.2.1方法測定條件下，反復(fù)測定了菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的添加回收率.結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度為0.1、1.0、10.0 mg/kg時(shí)，上述2種菊酯農(nóng)藥在菜心中的平均回收率為82.75% ～87.31%;標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.96～3.11;變異系數(shù)為1.31～2.67(表1).添加回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)均在農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則允許的范圍內(nèi)，說明所選定的方法完全符合農(nóng)藥殘留量分析與檢測的技術(shù)要求［16］.

表1 菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Recoveries of β-cypermethrin and fenvalerate from flowering Chinese cabbage

2.3 目標(biāo)菌株的室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果

室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，菜心中2種菊酯農(nóng)藥的殘留量均隨處理時(shí)間的延長而降低.其中，高效氯氰菊酯的殘留量降低較快，在降解菌株ZS-S-01處理36 h后，其殘留量低于國家葉菜類蔬菜中高效氯氰菊酯最大殘留限量(MRLs)，即1 mg/kg;氰戊菊酯的殘留量降低相對較慢，在降解菌株ZS-S-01處理72 h后其殘留量低于國家葉菜類蔬菜中氰戊菊酯MRLs，即0.5 mg/kg.處理72 h后，菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解率分別為71.1%和65.9%.菌株ZS-S-01處理菜心后高效氯氰菊酯和氰戊菊酯色譜圖見圖3.對照菜心中2種菊酯農(nóng)藥殘留量明顯高于噴施降解菌株的菜心處理，說明菌株ZS-S-01加快了菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解.

表2 降解菌株ZS-S-01對菜心中2種農(nóng)藥殘留動態(tài)的影響Tab.2 Effects of degradation of two insecticides on flowering Chinese cabbage by strain ZS-S-01

采用一級動力學(xué)模型，對 0、12、24、36、48、60 和72 h的農(nóng)藥殘留量和時(shí)間進(jìn)行擬合.擬合結(jié)果如表3所示.由表3可知，降解菌株ZS-S-01對高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解符合一級降解動力學(xué)模型，決定系數(shù)R2分別為0.980 8和0.971 5.通過計(jì)算得出，降解菌株ZS-S-01對菜心2種菊酯農(nóng)藥的降解半衰期(T1/2)分別為26.3和29.2 h，與對照相比，T1/2分別縮短了57.2和34.1 h.降解動力學(xué)分析進(jìn)一步證明該菌株能有效去除菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯農(nóng)藥殘留.

圖3 菌株ZS-S-01降解高效氯氰菊酯(a)和氰戊菊酯(b)的氣相色譜圖Fig.3 GC chromatograms of β-cypermethrin(a)and fenvalerate(b)treated by strain ZS-S-01

表3 菌株ZS-S-01對菜心中2種農(nóng)藥殘留降解的動力學(xué)參數(shù)1)Tab.3 Kinetics parameters of degradation of two insecticides on flowering Chinese cabbage by strain ZS-S-01

2.4 目標(biāo)菌株的田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果

田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明，菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的殘留量隨處理時(shí)間的延長而降低.在降解菌株ZS-S-01分別處理36和72 h后，菜心中2種菊酯農(nóng)藥殘留量均低于國家葉菜類蔬菜中MRLs.處理72 h后，菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解率分別為63.2%和54.0%(表2)，降解效果與室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果相比略低，可能是降解菌株在自然界中受到光照、溫度、pH等環(huán)境條件的影響.同樣，目標(biāo)菌株ZS-S-01對高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解符合一級降解動力學(xué)模型，R2分別為0.991 3和0.970 4，T1/2分別為27.7 和32.1 h，與對照相比，T1/2分別縮短了34.2和15.4 h(表3).

3 討論與結(jié)論

擬除蟲菊酯農(nóng)藥的殘留問題及其危害給我國的進(jìn)出口貿(mào)易帶來了重大損失，同時(shí)給環(huán)境帶來嚴(yán)重污染，甚至危害到人體健康.因此，國家相關(guān)部門及科研工作者高度重視，投入大量人力、財(cái)力來解決菊酯農(nóng)藥殘留問題，但效果甚微.近年來，隨著人們對生物修復(fù)理論(Bioremediation)的認(rèn)識，利用微生物去除環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留污染以其高效、廉價(jià)、安全、簡便等特點(diǎn)被廣泛研究應(yīng)用，前景看好.目前，國內(nèi)外對菊酯農(nóng)藥微生物降解菌株的篩選、特性及降解途徑研究已經(jīng)作了一定量工作，并已分離篩選到了若干降解菌，如芽孢桿菌屬 Bacillus sp.［12］、假單胞菌屬 Pseudomonas sp.［17］、曲霉菌屬 Aspergillus sp.［18］、酸單胞菌 Acidomonas sp.［19］、單胞菌屬 Sphingomonas sp.［20］、克雷伯氏桿菌屬 Klebsiella sp.［21］、微球菌 Micrococcus sp.［22］、假 單 胞 菌 屬 Rhodopseudomonas sp.［23］、腸桿菌屬 Enterobacter sp.［24］、鞘氨醇桿菌屬Sphingobium sp.［25］、鏈霉菌屬 Streptomyces sp.［26］、蒼白桿菌屬 Ochrobactrum sp.［27］等，包括細(xì)菌、放線菌和真菌，并取得了一定的研究進(jìn)展，但卻鮮見推廣應(yīng)用的實(shí)例.已有研究表明，降解菌株可有效去除蔬菜中的毒死蜱農(nóng)藥殘留［28］.Yu等［28］從土壤中分離獲得1株毒死蜱降解菌Verticillium sp.DSP，該菌株處理受毒死蜱污染的小白菜、空心菜、木耳菜、扁豆和辣椒7 d，其殘留量均低于MRLs.本研究針對菊酯農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀，對本實(shí)驗(yàn)課題組篩選獲得的菊酯農(nóng)藥高效降解菌株Stenotrophomonas sp.ZS-S-01處理受污染菜心的效果進(jìn)行評價(jià).室內(nèi)盆栽和田間小區(qū)試驗(yàn)研究結(jié)果均表明，降解菌株ZS-S-01可有效去除菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯農(nóng)藥殘留，分別處理36和72 h后，其殘留量均低于葉菜類蔬菜中MRLs，且降解過程符合一級動力學(xué)模型，與對照相比，T1/2明顯縮短，顯示該菌進(jìn)一步開發(fā)的潛力.本試驗(yàn)報(bào)道的降解菌株有效去除高效氯氰菊酯和氰戊菊酯農(nóng)藥殘留的時(shí)間比丁海濤等［12］報(bào)道的降解菌株 Bacillus licheniformis qw5去除溫室和小區(qū)青菜中的氯氰菊酯和氰戊菊酯殘留的時(shí)間(5 d)明顯縮短.試驗(yàn)結(jié)果還表明，降解菌株ZS-S-01處理72 h后，室內(nèi)盆栽菜心中高效氯氰菊酯和氰戊菊酯的降解率分別為71.1%和65.9%，田間小區(qū)的降解率分別為63.2%和54.0%，說明室內(nèi)盆栽的降解效果要好于田間小區(qū)的降解效果，主要是由于室外環(huán)境條件變化較大，如光照、溫度、pH、微生物群落和土壤結(jié)構(gòu)等，這些因素均可以影響微生物的降解效果［29］.另外，大量研究表明，菌株Stenotrophomonas sp.在自然界廣泛分布，在水、土壤、植物根系及食物(冷凍魚類、牛奶、禽蛋)等都有該菌的存在［30］.本試驗(yàn)結(jié)果也表明，菌液對菜心無致病性.當(dāng)然，應(yīng)用微生物去除蔬菜中的農(nóng)藥殘留還有許多問題有待進(jìn)一步解決，例如，如何使降解菌株的實(shí)際應(yīng)用效果與實(shí)驗(yàn)室條件下的降解效果接近;如何在生產(chǎn)應(yīng)用上克服溫度、pH、光照等外界環(huán)境因素作用于降解菌株的影響;如何評價(jià)降解菌株的安全性等問題.

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