姚 亮

湖南省衡陽(yáng)市中心醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001

清火片由大青葉、大黃、石膏、薄荷腦等4味藥組成的復(fù)方制劑，功能清熱瀉火，通便。用于咽喉腫痛，牙痛，頭目眩暈，口鼻生瘡，風(fēng)火目赤，大便不通等。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)第2冊(cè)第244頁(yè)收載品種。［1］大黃為本方中有效成分之一，而大黃主要成分為大黃素和大黃酚，因此測(cè)定本品中大黃素和大黃酚的含量，可作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，保證藥品使用安全、有效，參考有關(guān)文獻(xiàn)［2－4］，本文采用 HPLC法測(cè)定了大黃素和大黃酚的含量及含量均勻度。

1 儀器與試藥

儀器 日本島津LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10AVP紫外檢測(cè)器;LC－10ATVP7725(i)型手動(dòng)進(jìn)樣器;威瑪龍色譜工作站;phenomenex HyperClone柱 (C18，4.6×250mm，5μm);kh－250db型超聲處理器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

試藥 甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。大黃素、大黃酚對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為:110756－200110、110796－200412。清火片 (購(gòu)自A廠，共3批)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 譜條件 色譜柱:phenomenex HyperClone柱 (C18，4.6×250mm，5μm);流動(dòng)相為甲醇－0.1%磷酸溶液 (85∶15)，流速為1.0ml· min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量為20μl;柱溫為室溫;理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。在上述色譜條件下，大黃素、大黃酚能完全分離，對(duì)照品與陰性對(duì)照品溶液中沒(méi)有峰重疊，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品各10.0mg，分別置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取大黃素對(duì)照品溶液2.5ml，大黃酚對(duì)照品溶液20ml，置100ml容量瓶中，加甲醇制成每1ml含大黃素2.5ug、大黃酚20ug的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取1g，置錐形瓶中，精密加乙醇50ml，密塞，稱定重量，置水浴上加熱回流1小時(shí)，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10ml，置燒瓶中，水浴蒸干，加30%乙醇－鹽酸 (10∶1)混合液15ml，置水浴中加熱回流1小時(shí)，立即冷卻，用三氯甲烷強(qiáng)力振搖提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇－醋酸乙酯 (2∶1)溶解，移置25ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μl，以上述色譜條件測(cè)定，根據(jù)大黃素、大黃酚峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算供試品中大黃素、大黃酚含量。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品各10.0mg，分別置100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成100μg· ml對(duì)照品溶液，備用。(1)、分別精密吸取 100μg· ml－1大黃素對(duì)照品溶液 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5ml，分別置100ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得 (每1ml中含大黃素分別為0.5μg、1.5μg、2.5μg、3.5μg、4.5μg、5.5μg)，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo) (X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=34528X－1075.5，相關(guān)系數(shù)r=0.9995;(2)、分別精密吸取100μg· ml－1大黃酚對(duì)照品溶液2.5、5、10、15、20、25ml，分別置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得 (每1ml中含大黃酚分別為 5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg)，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo) (X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo) (Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=50351X－18680，相關(guān)系數(shù)r=0.9992。結(jié)果表明:大黃素進(jìn)樣濃度在0.5～5.5μg· ml－1范圍內(nèi)，大黃酚進(jìn)樣濃度在5～50μg· ml－1范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取大黃素、大黃酚混合對(duì)照品溶液 (大黃素2.5μg· ml－1、大黃酚20μg· ml－1) 和供試品溶液 (批號(hào)20100601)各20μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，依次測(cè)定峰面積值，其中大黃素RSD為0.41%、大黃酚RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 (批號(hào)20100601)，每隔4小時(shí)分別進(jìn)樣20μl，測(cè)定大黃素、大黃酚峰面積值，其峰面積RSD分別為1.39%、1.83%，表明供試品溶液在20小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.8 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按處方比例取處方中缺大黃的各味藥材，照制法制取缺大黃樣品。取陰性樣品1.0g，并按供試品溶液提取方法制成陰性對(duì)照溶液，測(cè)定，在上述色譜條件下，缺大黃陰性對(duì)照溶液，在大黃素和大黃酚色譜峰處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，表明對(duì)被測(cè)成分無(wú)干擾。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)供試品 (批號(hào)20100601)共5份，每份約1g，精密稱定，按供試品溶液項(xiàng)下的方法制備，測(cè)定，結(jié)果測(cè)得總量平均值1.743 mg/片，RSD%=0.38，大黃素平均值0.223 mg/片，RSD%=1.54，大黃酚平均值1.521 mg/片，RSD%=0.28，表明重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 加樣回收試驗(yàn):取已測(cè)知含量的供試品 (批號(hào)050315，含量:總量1.743 mg/片，大黃素0.223 mg/片，大黃酚平均值1.521 mg/片)5份，每份約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入100μg· ml－1大黃素對(duì)照品溶液 (精密量取大黃素對(duì)照品溶液10.0mg，置100ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)4.7ml和大黃酚對(duì)照品3mg，照供試品溶液項(xiàng)下的方法制備，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2 大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品中大黃素、大黃酚的含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液3批，按上述色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.12 樣品中大黃素、大黃酚的含量均勻度測(cè)定 取樣品3批，按供試品溶液制備方法提取，以上述色譜條件依法(2010年版藥典二部附錄XE)測(cè)定大黃素、大黃酚含量均勻度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量及含量均勻度測(cè)定結(jié)果

3 討論

HPLC在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，取大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，甲醇為溶劑，經(jīng)紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描，大黃素和大黃酚在254nm處有最大吸收，靈敏度高，因此，選擇254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，該方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，靈敏度高，樣品分離效果好，可用于清火片的質(zhì)量控制方法。

［1］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.中藥成方制劑，第二冊(cè)，WS3－B－041－90.

［2］劉善新，馬毅，鐘方曉，等.HPLC法測(cè)定復(fù)方大黃利膽片中大黃素、大黃酚的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007，13(12):13－14.

［3］周勇高，韓燕全，孟楣.HPLC法同時(shí)測(cè)定苦黃軟膏中大黃素、大黃酚的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(4):430－431.

［4］盛燕，汪培鈞，張文婷，等.高效液相法測(cè)定婦樂(lè)顆粒中大黃素和大黃酚的含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19(8):46－47.