廖晶晶 徐建國(guó) 楊偉俊 劉沖 地力努爾 滿爾哈巴

唇形科新塔花屬ZiziphoraL.在中國(guó)分布4種，均產(chǎn)新疆，其中芳香新塔花(Z.clinopodioidesLam.)資源最為豐富，生長(zhǎng)于南北疆各山區(qū)的山地草地、礫石質(zhì)坡地及半荒漠草灘上。由于其獨(dú)特的芳香氣味，也是一種牛羊等牲畜喜食的牧草。芳香新塔花藥用地上部分，系維吾爾醫(yī)和哈薩克醫(yī)習(xí)用藥材，性“二級(jí)干寒”。芳香新塔花具有強(qiáng)心利濕，理氣化痰，消炎散結(jié)之功能，用于心臟病，氣短多汗，水腫，氣管炎等疾患[1]；也可用于感冒發(fā)熱，高血壓，心悸失眠等癥[2]。中醫(yī)臨床上也用于治療高血壓以及心肌缺血[3，4]。芳香新塔花具強(qiáng)烈的芳香氣味，地上部分含揮發(fā)油、萜類、生物堿、黃酮類等[5-9]。課題組從事芳香新塔花藥材繁育、規(guī)范化種植、化學(xué)研究及新藥開發(fā)等方面的研究工作多年，首次起草并制定了芳香新塔花藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10]。通過(guò)對(duì)中國(guó)新塔花屬進(jìn)行系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，芳香新塔花具有顯著的藥理活性[11]，采用藥效活性追蹤的研究方法，從具有活性的部位中分離得到了一系列黃酮類化合物[9]，并采用溶劑提取、大孔吸附樹脂分離純化得到芳香新塔花總黃酮有效部位(Z. clinopodioides flavonoids，ZCF)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究ZCF體外抗氧化活性以及對(duì)缺氧—復(fù)氧損傷和氧化損傷的心肌細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步探索藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠乳鼠(出生1～3天)，雌雄不限，均由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：新醫(yī)動(dòng)字SYXK(新)2003-0001。

1.2 藥物

芳香新塔花黃酮(ZCF)，新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥研究室制備，純度71.0%，黃色粉末。

1.3 試劑

二苯代苦味酰自由基 (2,2-diphenyl-l- picrylhydrazyl，DPPH·)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。MTT，Amresco公司，批號(hào)：080717。胰酶，Amresco0458，批號(hào)：081011。鏈霉素，華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)081112。DMEM培養(yǎng)粉(高糖、低糖)，Invitrogen Corporation產(chǎn)品，批號(hào)：081004。注射用氨芐西林鈉，中諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：081120。其它所用試劑均為分析純。丙二醛(MDA)測(cè)試盒，批號(hào)：090103，100T，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.4 儀器

DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Shimadzu UV-2501 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津制造所)；BS124S電子天平(塞多利斯)；。

1.5 ZCF清除 DPPH·實(shí)驗(yàn)

精確吸取ZCF貯備液，用乙醇稀釋為0.01 mg/ml、0.0125 mg/ml、0.0167 mg/ml、0.025 mg/ml、0.05 mg/ml的系列溶液，取各濃度溶液2 ml，加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·，搖勻，反應(yīng)30 分鐘 后，在紫外可見分光光度計(jì)上，517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，記錄吸光度值為A樣品。用2 ml無(wú)水乙醇加入2 ml 2×10-4mol·L的DPPH·溶液為空白對(duì)照，搖勻，反應(yīng)30 分鐘測(cè)得的吸光度為A空白對(duì)照，計(jì)算公式為：DPPH·清除率(%)=[1-A樣品/A空白對(duì)照]×100%。

同上法，測(cè)定不同濃度維生素C(VC)溶液的A樣品VC，A空白對(duì)照VC。

1.6 ZCF對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用[12]

1.6.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 出生1～3天SD大鼠乳鼠，無(wú)菌取出心臟，冷PBS溶液清洗后剪碎成約1～3 mm3的小塊，0.25%胰酶分次消化，再離心分離細(xì)胞，用DMEM(含10%胎牛血清)懸浮轉(zhuǎn)移并接種于培養(yǎng)瓶中，差速貼壁純化法，除去成纖維細(xì)胞。初步純化后的乳鼠心肌細(xì)胞懸液(1×105/ml)分別接種并培養(yǎng)3～4天，用于實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn) 心肌細(xì)胞與不同濃度的藥物共育24 小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，每孔加無(wú)血清的DMEM 180 μl和MTT 20 μl，培養(yǎng)4 小時(shí)，除去上清，每孔加DMSO 150 μl，混合均勻后，10 分鐘內(nèi)在570 nm處測(cè)吸光度(A)值。

1.6.3 缺氧—復(fù)氧模型的建立 心肌細(xì)胞培養(yǎng)72 小時(shí)后，用缺氧液(預(yù)先用高濃度氮?dú)怙柡偷呐囵B(yǎng)液)置換正常培養(yǎng)液，放入缺氧培養(yǎng)箱(氮?dú)?9.99%)，缺氧120分鐘，再用模擬再灌注液置換復(fù)氧液(預(yù)先用純氧飽和培養(yǎng)液)于5% CO2、37℃溫箱中復(fù)氧60分鐘，用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)MDA的量。

1.6.4 試藥對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧—復(fù)氧的影響 由細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)確定ZCF實(shí)驗(yàn)劑量，并將實(shí)驗(yàn)分為6組：正常細(xì)胞培養(yǎng)組(培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3 小時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn))；缺氧—復(fù)氧損傷模型組(缺氧2 小時(shí)，復(fù)氧1小時(shí))；缺氧—復(fù)氧損傷+ZCF各劑量組(缺氧2 小時(shí)，復(fù)氧1 小時(shí)，缺氧—復(fù)氧時(shí)均給藥)。以不加試藥的細(xì)胞培養(yǎng)液孔的吸光度均值與加試藥各孔的吸光度均值之比作為抑制率，取2次測(cè)定的抑制率的平均值作為最終抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)處理用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZCF清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以DPPH·清除率對(duì)ZCF濃度作圖，發(fā)現(xiàn)ZCF及VC對(duì)DPPH ·有較好的清除作用，且ZCF對(duì)DPPH·的清除作用與ZCF及VC的添加量呈正相關(guān)，量效關(guān)系顯著。線性回歸方程為y = 17.93 x-3.31，r2= 0.9951。得出ZCF的半數(shù)清除濃度IC50= 0.017 mg/ml。同法算得VC的半數(shù)清除濃度IC50= 0.01 mg/ml。結(jié)果見圖1。

圖1 ZCF清除DPPH·實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 ZCF對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧—復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

2.2.1 MTT測(cè)定結(jié)果 ZCF劑量低于12.5 μg/ml劑量組時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞缺氧—復(fù)氧損傷的抑制率在50%左右。結(jié)果見表1。

表1 不同濃度芳香新塔花總黃酮

2.2.2 MDA測(cè)定結(jié)果 與正常組比較，模型組的MDA水平顯著降低(P﹤0.01)，說(shuō)明模型成立。與模型組比較，ZCF各劑量組MDA的量均下降且呈劑量依賴關(guān)系，高、中、低三個(gè)劑量組MDA與模型組的差異非常顯著(P﹤0.01)。結(jié)果見表2。

表2 ZCF對(duì)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞缺氧—

3 討論

黃酮類化合物亦稱類黃酮或生物類黃酮，主要是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，其基本結(jié)構(gòu)式由兩個(gè)苯環(huán)(A和B)通過(guò)中間雜環(huán)的吡喃或吡喃酮(C)相連接，具有15個(gè)碳原子的多元酚化合物，廣泛存在自然植物中，有多種生物學(xué)活性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)黃酮類化合物具有抗自由基、抗腫瘤、抗病毒作用，對(duì)心腦缺血損傷、肝損傷、心律失常有保護(hù)作用，此外，還有降壓、降血脂、抑制血小板聚集等多種藥理作用。現(xiàn)已證明心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展與自由基對(duì)心肌組織細(xì)胞的損傷關(guān)系密切。DPPH·是一種穩(wěn)定存在的有機(jī)自由基，由于苯環(huán)的內(nèi)軛和位阻及硝基的吸電子作用，呈現(xiàn)紫色被還原后變?yōu)闇\黃色，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系在517nm附近的吸收峰的下降程度可以直接評(píng)價(jià)其抗氧化活性，變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，這種方法廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評(píng)價(jià)和抗氧化劑的篩選。本文試驗(yàn)結(jié)果顯示，ZCF的IC50為0.017 mg/ml，而VC的IC50為0.01 mg/ml。說(shuō)明ZCF具有較強(qiáng)的自由基清除作用。

心肌細(xì)胞缺氧—復(fù)氧模型可分別造成模擬心肌缺血與缺血后再灌注損傷模型，而在此模型中自由基損傷起著關(guān)鍵性作用[13]，心肌缺血—再灌注后，機(jī)體通過(guò)多種途徑產(chǎn)生氧自由基，氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞膜及亞細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化是心肌缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，而MDA是自由基攻擊生物膜引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其量可反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，可作為評(píng)價(jià)氧自由基攻擊程度的指標(biāo)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，心肌細(xì)胞在缺氧—復(fù)氧后，培養(yǎng)液中MDA的量顯著增加，而加入ZCF后，MDA含量均有明顯下降，表明ZCF能提高心肌細(xì)胞抗氧化能力，對(duì)心肌細(xì)胞缺氧—復(fù)氧具有一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用DPPH·清除活性方法來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)自由基的清除能力，并通過(guò)ZCF對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的影響，利用MDA的含量來(lái)觀察細(xì)胞受自由基攻擊程度，結(jié)果提示ZCF保護(hù)心肌損傷的機(jī)制可能與其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。

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