孫曉紅,楊艷秋,賀 丹,張?jiān)品?橫山耕治,王 麗*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,吉林長春130021;2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院;4.日本千葉大學(xué)真菌醫(yī)學(xué)研究中心)

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱為簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeats,SSR),是指基因組中由l-6個(gè)核苷酸為基本單位的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成的一段DNA。廣泛分布于真核生物基因組中,由于其在群體中的多態(tài)性高,且一般為共顯性遺傳,已成為一種很好的分子遺傳標(biāo)記。目前在真菌的研究中,SSR主要用于種群遺傳多樣性、近緣種間及種內(nèi)的系譜研究、基因分型等[1-4]。

近年來,醫(yī)院內(nèi)真菌感染日益增多,且主要表現(xiàn)為條件致病真菌感染。其中,假絲酵母居于第一位,但在國內(nèi)及國外的多項(xiàng)研究中,檢出的假絲酵母各菌種的構(gòu)成比有很大差異[5,6]。為了追溯感染的來源,更有利于真菌感染的治療,有必要使用分子生物學(xué)方法對假絲酵母進(jìn)行正確的鑒定。以PCR為基礎(chǔ)的SSR技術(shù),因其對DNA質(zhì)量要求不高及引物的通用性好等特點(diǎn),對菌種的鑒定具有特殊意義[7,8]。本研究確定了SSR-PCR反應(yīng)最適的退火溫度,利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系,建立了最佳的SSR-PCR反應(yīng)體系。旨在為將該技術(shù)用于臨床假絲酵母感染的快速鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

熱帶假絲酵母(Candidaparapsilosis)(JLCC33785)為SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)菌株,所用菌株由吉林大學(xué)真菌研究中心菌種保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center,JLCC)保藏。

1.2 主要試劑及儀器

SSR引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì),寶生物(大連)工程有限公司合成;dNTP、Taq DNA聚合酶和DNA marker購自寶生物(大連)工程有限公司;美國ASTEC基因擴(kuò)增儀PC-320。

1.3 基因組DNA提取

采用Gene TLETM酵母菌DNA快速抽提方法并進(jìn)行改進(jìn)[9]:①取 100-200 mg菌絲體,加入540 μ l SolutionⅠ ,混勻 ;②加入 60 μ l SolutionⅡ ,混勻 ,95 ℃金屬浴10 min;③加入300 μ l Solution Ⅲ,顛倒混勻,冰浴 2 min;④12 000 rpm 、4℃離心 10 min,取 600 μ l上清于一新EP管中;⑤加入等體積異丙醇,混勻,12 000 rpm、4℃離心 5 min,棄上清 ;⑥加入 200 μ l-20℃的70%冷乙醇洗滌,12 000 rpm、4℃離心5 min,棄上清;⑦沉淀物置于離心濃縮儀中真空干燥;⑧獲得的DNA,加入40 μ l ddH2O 溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)條件

根據(jù)引物Tm值,設(shè)立6個(gè)梯度的退火溫度,依次為 48℃、49℃、50℃、51 ℃、52℃、53℃。PCR 反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min;94℃變性1 min,退火1 min,72℃延伸 90 s;40個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?。取反?yīng)產(chǎn)物10 μ l,于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色30 min,置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

1.5 SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

以Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物為實(shí)驗(yàn)因素,進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系(表1),即選用L9(34)正交表進(jìn)行9種組合的實(shí)驗(yàn)(表2)。

表1 SSR-PCR反應(yīng)體系正交實(shí)驗(yàn)的水平和因素

表2 SSR-PCR反應(yīng)體系正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表L9(34)

2 結(jié)果

2.1 退火溫度對SSR-PCR反應(yīng)的影響

退火溫度將會直接影響PCR擴(kuò)增的結(jié)果。為此,本研究根據(jù)理論Tm值將退火溫度分別設(shè)置為48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃。其結(jié)果明顯不同:泳道1、2、3擴(kuò)增的非特異條帶多,背景彌散;泳道4擴(kuò)增的條帶清晰,多態(tài)性好;泳道5擴(kuò)增的條帶明亮,但多態(tài)性低;泳道6幾乎沒有擴(kuò)增出條帶。所以選擇泳道4對應(yīng)的51℃為最適退火溫度(圖1)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)體系

通過4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn),共9種組合,對SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。每一組合的結(jié)果存在顯著差異,泳道1沒有擴(kuò)增出條帶;泳道2擴(kuò)增條帶弱;泳道3、4、8擴(kuò)增的條帶較亮,但多態(tài)性低;泳道5、6、7、9擴(kuò)增條帶均較清晰,多態(tài)性高,其中以泳道6的效果最好;對泳道5、6、7、9的反應(yīng)體系進(jìn)行比較,確定泳道6各因素濃度作為最佳的反應(yīng)體系:25μ l SSR-PCR反應(yīng)體系中,加入Taq DNA聚合酶1.0 u 、模板 DNA 為 25 ng、dNTP 為 0.15 mmol·L-1、引物為 0.5 μ mol·L-1(圖 2)。

2.3 模板濃度對SSR-PCR反應(yīng)體系的影響

在正交實(shí)驗(yàn)中確定了最佳的模板用量為25 ng,為3水平中的最高值。為了驗(yàn)證SSR反應(yīng)體系的靈敏度,設(shè)置了不同的模板梯度,依次為5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35ng。電泳結(jié)果表明,泳道1、2擴(kuò)增的條帶相對較弱;泳道 3、4、5、6擴(kuò)增的條帶較亮且清晰,且以泳道5、6擴(kuò)增的效果好,這和正交實(shí)驗(yàn)中確定的模板用量基本一致;泳道7擴(kuò)增的條帶較亮,但多態(tài)性低(圖3)。

2.4 反應(yīng)體系的穩(wěn)定性驗(yàn)證

使用優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系及條件,對6株臨床分離鑒定的熱帶假絲酵母進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝膠電泳后均得到明亮、清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的條帶,長度分別約為480 bp、750 bp、1750 bp,證實(shí)該體系具有較好的的穩(wěn)定性(圖4)。

3 討論

SSR作為一種很好的分子遺傳標(biāo)記,其高度的多態(tài)性優(yōu)于 RFLP、重復(fù)性強(qiáng)于RAPD。對于SSRPCR技術(shù),其結(jié)果多用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測,雖分辨率高,但操作復(fù)雜、成本較高。本研究使用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,可得到清晰穩(wěn)定的多態(tài)性條帶,操作簡單,在普通實(shí)驗(yàn)室易于開展。

PCR反應(yīng)受許多因素影響,退火溫度的高低會直接影響PCR擴(kuò)增結(jié)果。溫度過低非特異條帶多,溫度過高會影響引物和模板的結(jié)合,甚至無PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。本研究設(shè)置48℃～53℃6個(gè)梯度的退火溫度,其中,51℃擴(kuò)增的條帶清晰、明亮,將其作為最適的退火溫度。這說明每一引物,有其適宜的退火溫度。

圖1 退火溫度對SSRPCR反應(yīng)的影響

圖2 正交實(shí)驗(yàn)SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的電泳圖

圖3 模板濃度對SSR-PCR反應(yīng)體系的影響

圖4 臨床菌株驗(yàn)證反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

本研究采用4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn),對SSRPCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,建立了最佳的反應(yīng)體系,在動態(tài)環(huán)境中考慮到PCR反應(yīng)各因素的相互作用。因?yàn)楦饕蛩貪舛冗^低時(shí),可能無法擴(kuò)增出產(chǎn)物;濃度過高時(shí),非特異性條帶可能增多及出現(xiàn)彌散狀背景[10]。dNTP既是PCR反應(yīng)的原料,又可以與PCR反應(yīng)中的Mg2+結(jié)合,如 dNTP濃度過高,使Mg2+濃度下降而影響Taq DNA聚合酶的活力;另外,引物濃度過高,易引起非特異性擴(kuò)增及形成引物二聚體[11]。從節(jié)約的角度考慮,只要能擴(kuò)增出清晰、明亮、穩(wěn)定、多態(tài)性高的條帶,Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物的用量應(yīng)越低越好,在圖 2中,泳道 5、6、7、9擴(kuò)增的條帶均較亮且清晰,但綜合考慮各因素的濃度,選擇泳道6對應(yīng)的各因素濃度作為最佳的SSR-PCR反應(yīng)體系。

在確定的最佳SSR-PCR體系中,模板DNA為25 ng,為3水平中的最高值。所以我們又設(shè)置7個(gè)梯度的模板濃度,濃度為5 ng-30 ng時(shí),基本上均可得到清晰的電泳條帶。這說明模板濃度對該反應(yīng)的影響不大及PCR反應(yīng)的高靈敏性,也證實(shí)通過變換某單一因素而固定幾種其他因素來確定PCR反應(yīng)體系的局限性。

綜上分析,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系,操作簡便,電泳條帶清晰,多態(tài)性好,重復(fù)性強(qiáng)。為將本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的SSR引物,進(jìn)一步用于假絲酵母的鑒定奠定基礎(chǔ)。

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