姜鐵超,鄒穎剛,于曉艷,楊 萍*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林長春130033;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院;3.吉林大學(xué)藥學(xué)院)

心肌纖維化(myocardial fibriosis,MF)是指在心肌細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量顯著升高。這種病理變化在多種心血管疾病中存在,是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變,是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一[1-5]。成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors,FGF),又稱為肝素結(jié)合因子,是一組蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的多基因大家族。到目前為止,發(fā)現(xiàn)FGF超家族共有23個(gè)成員,分別命名為FGF1-23。本實(shí)驗(yàn)旨在探討bFGF在大鼠MF中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(Iso),由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn);羊抗大鼠FGF單克隆抗體,由博士德公司提供;SP-9000免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒,由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供;萊卡4215切片機(jī)(德國);OlympusPM-10AO全自動(dòng)顯微照相裝置(日本)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性Wistar大鼠20只,體重180-220 g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分為正常對照組及Iso組(包括12 h,72 h及1周組),每組5只。

1.3HE組織化學(xué)染色取材經(jīng)10%福爾馬林固定30 min,常規(guī)石蠟包埋。用二甲苯脫臘10 min,用100%乙醇置換二甲苯2 min、95%乙醇置換1 min、80%乙醇置換1 min及用75%乙醇置換1 min,蒸餾水沖洗2 min。蘇木素染色5 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s。自來水浸泡15 min。伊紅染 2 min。常規(guī)脫水,透明,中性樹膠封閉劑封片。

1.4bFGF蛋白組織化學(xué)染色石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min。3%H2O2去離子水(無色液體)孵育5-10 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加試劑A(藍(lán)色液體)室溫孵育10-15 min,傾去,勿洗。滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,4℃過夜。PBS沖洗,3 min×3次。滴加試劑B(黃色液體),室溫或37℃孵育10-15 min。PBS沖洗,3 min×3次。滴加試劑C(橙色液體),室溫孵育10-15 min。PBS沖洗,3 min×3次。DAB顯色。自來水充分沖洗。復(fù)染,脫水,透明。中性樹膠封閉劑封片。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示,采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1HE與bFGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果正常對照組心肌排列整齊,橫紋清晰,胞核明顯,無細(xì)胞腫脹。注射Iso 12 h后,心肌出現(xiàn)較多點(diǎn)狀壞死。注射Iso 1周后,出現(xiàn)界限清晰、多發(fā)散在壞死灶,壞死灶內(nèi)有旺盛的成纖維細(xì)胞增生,并可見一定量的膠原纖維。圖1。

Fig.1 The observation results of HE under light microscope(×400).A:control group;B:Iso 12 h;C:Iso 1 w.

2.2Masson三色染色結(jié)果

在注射 Iso12 h后,膠原量即明顯增加(P＜0.01),此后,膠原量逐漸增加,藍(lán)染面積擴(kuò)大且顏色加深,且膠原排列紊亂,直至 1 w達(dá)到高峰。bFGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,正常對照組中可見呈淺黃色或棕褐色陽性物質(zhì)。注射Iso 12 h后,bFGF陽性物質(zhì)表達(dá)明顯增加,具體結(jié)果見表1及圖2,3。

Fig.2 The observation results of Masson under light microscope(×400).D:control group;E:Iso12 h;F:Iso 1 w

Fig.3 The observation results of bFGF under light microscope(×400).D:control group;E:Iso 12 h;F:Iso1 w

表1 注射 Iso后 NF-κ B表達(dá)

3 討論

近幾年研究發(fā)現(xiàn),FGF有幾種異構(gòu)體,在動(dòng)脈硬化灶中起作用的主要是bFGF(basic fibroblast growth factor),bFGF可以由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌。它的作用是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的游走和平滑肌細(xì)胞的增殖,不能使平滑肌細(xì)胞游走。能夠促進(jìn)新血管形成,修復(fù)損害的內(nèi)皮細(xì)胞。FGF被認(rèn)為是病灶形成促進(jìn)因子,但從修復(fù)角度看它也有有利的一面。酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acidic FGF,aFGF)又稱為FGF1,是FGF家族中最早的成員之一,其對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。bFGF對實(shí)驗(yàn)大鼠心肌缺血再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用。bFGF是心血管系統(tǒng)細(xì)胞的強(qiáng)烈絲裂原,對血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均有很強(qiáng)的促絲裂作用。bFGF是近年來發(fā)現(xiàn)的在動(dòng)脈粥樣硬化和血管損傷過程中介導(dǎo)血管平滑肌增殖的細(xì)胞因子。bFGF可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮長入膠原基質(zhì)中形成血管腔增加新生血管,從而改善局部缺血。bFGF對防止急性心肌梗死的延展和促進(jìn)梗死區(qū)側(cè)枝循環(huán)重建及心肌梗死后心功能恢復(fù)有積極作用。在狗的冠狀動(dòng)脈內(nèi)注入栓子造成心肌梗死,bFGF冠狀動(dòng)脈注射治療組能改善心肌功能,搶救心肌缺血,縮小壞死面積。組織學(xué)和血管造影等發(fā)現(xiàn)梗死部位有毛細(xì)血管和小動(dòng)脈增加。bFGF緩釋微膠囊治療組實(shí)驗(yàn)兔的心肌梗死面積較對照組明顯減小,且缺血區(qū)微血管計(jì)數(shù)明顯增高[6-8]。新近發(fā)現(xiàn)bFGF具有降血壓作用,是由于bFGF可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性舒緩因子合成增加,導(dǎo)致血管舒張[9]。另有研究發(fā)現(xiàn),[9-11]bFGF表達(dá)在間質(zhì)纖維化的腎臟標(biāo)本中明顯升高,而bFGF可強(qiáng)有力誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生。Strutz等在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),用TGF-β1孵育6 h后,bFGF mRNA升高3.5倍,認(rèn)為TGF-β1誘導(dǎo)bFGF合成在TGF-β1介導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。然而,有關(guān)bFGF在MF中的作用,目前未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用多點(diǎn)皮下注射Iso復(fù)制大鼠心肌壞死模型。HE染色結(jié)果顯示,在注射Iso 12h后即出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死,隨時(shí)間的延長缺血壞死面積明顯增加,1周達(dá)到高峰,出現(xiàn)明顯的纖維化。HE組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果提示,注射Iso可成功地引起大鼠心肌缺血性壞死,Masson結(jié)果亦顯示,其膠原含量隨Iso注射時(shí)間的延長,而逐漸增加(P＜0.01)。為探討bFGF在大鼠缺血性MF中的作用,本文作者應(yīng)用免疫組織化學(xué)及RT-PCR方法,對缺血性心肌壞死所致MF發(fā)生發(fā)展過程中,bFGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察,結(jié)果表明:多點(diǎn)皮下注射Iso引起大鼠心肌缺血性壞死后,bFGF蛋白表達(dá)隨時(shí)間的延長,蛋白表達(dá)逐漸增加(P＜0.01),提示bFGF參與了大鼠心肌壞死后纖維化的發(fā)生及發(fā)展過程。

[1]張 運(yùn),徐 瑞.心肌纖維化-心力衰竭治療的新靶標(biāo)[J].中華醫(yī)藥雜志,2006,86(17):58.

[2]張召才,楊英珍.心肌纖維化的研究進(jìn)展[J].臨床心血管病雜志,2004,20(1):58.

[3]姜秀春,姜秀麗,李樹青.心肌纖維化發(fā)病機(jī)制和防治的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2006,12(15):931.

[4]肖厚勤,丁 國,華張建,等.環(huán)氧合酶-2抑制劑對梗阻性腎病大鼠腎組織結(jié)締組織生長因子表達(dá)的影響[J].家用醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(3):241.

[5]高海成,于曉艷,李相軍,等.環(huán)氧合酶2在心肌纖維化中的表達(dá)及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2008,34(2):233.

[6]Kawai C.From myocarditis to cardiomyopathy:Mechanisms of inflammation and cell death:Learning from the past for the future[J].Circulation,1999,99(2):1091.

[7]Schnee J M,Hsueh W A.AngiotensiⅡ,adhesion,and cardiac fibrosis[J].Cardiaovasc Res,2000,46(2):264.

[8]Kobori H,Lchihara A,Miyashits Y,et al.Local rennin-angiotensin system contributes to hyperthyroidism-induced cardial hypertrophy[J].J Endocrinol,1999,160(1):43.

[9]Hong BK,Kwon HM,ByunKH,et al.Apoptosis in dilated cardiomyopathy[J].Korean J Intern Med,2000,15(1):56.

[10]Li P F,Dietz R,Von Harsdorf R.Superoxide induces apoptosis in cardiomyocytes,but proliferation and expression of transforming growth factorbeta1 in cardiac fibroblasts[J].FEBS Lett,1999,448(2):206.

[11]王健東,潘星華.細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的分子遺傳機(jī)制[J].國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊,1996.19(2):116.