楊 柳,蘇明權(quán),馬越云,焦 剛,常 亮,肖鳳靜,李 明,彭年才,郝曉柯*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心,陜西西安710032;2.西安天隆科技有限公司,陜西西安710043)

沙門氏菌是一種常見、重要的人獸共患病原菌,在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義[1]。沙門氏菌是主要的腸道致病菌,易引起食物中毒。在我國(guó),以沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的首位[2]。目前對(duì)食品中的沙門氏菌檢測(cè)手段仍采用常規(guī)生物學(xué)培養(yǎng)鑒定法輔以抗原和抗體的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),病原微生物分離培養(yǎng)、生理生化鑒定、血清分型和免疫酶等表型特征檢測(cè)方法,常規(guī)方法繁瑣、耗時(shí)耗力,不能滿足日益發(fā)展的需要。因此,為有效地預(yù)防和控制疾病發(fā)生,建立快速、敏感而又特異的檢測(cè)沙門氏菌的方法是非常必要的。本研究根據(jù)沙門氏菌全基因組中fimY基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),建立沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,為食源性沙門氏菌污染的快速檢測(cè)提供方法學(xué)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 傷寒沙門氏菌(ATCC14028)購(gòu)自中國(guó)菌種保藏中心;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、福氏痢疾志賀氏菌、腸球菌為本科經(jīng)臨床分離鑒定后的保存菌株。

1.1.2儀器和試劑 所用儀器為美國(guó)ABI公司的PE7700型基因定量擴(kuò)增儀和西安天隆科技有限公司的TL580型熒光定量PCR儀;主要試劑為PCR Mix、Taq酶、dNTP、細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 采用沙門氏菌fimy基因序列[4]設(shè)計(jì)引物和探針,以FAM為報(bào)告基團(tuán),以TAMRA為淬滅基團(tuán),引物和探針均由TaKaRa公司合成。其引物和探針序列分別為:

上游引物:5′-TCGTCATTCCATTACCTACC-3′;

下游引物:5′-AAACGTTGAAAAACTGAGGA-3′。

探 針 序 列:5′ FAM-TCTGGTTGATTTCCTGATCGCA-TAMRA3′。

1.2 方法

1.2.1沙門氏菌重組標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.2.1.1目的基因的擴(kuò)增 以傷寒沙門氏菌作為實(shí)驗(yàn)菌株提取模DNA,應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,獲的目的擴(kuò)增片段,產(chǎn)物回收純化后測(cè)吸光度定量。

1.2.1.2目的片段與載體的連接 在10 μ l連接反應(yīng)體系中,包括:2 ×Buffer 5 μ l,PGEM-T-easy vector 1 μ l,PCR 產(chǎn)物 2 μ l,T4 DNA 連接酶 1 μ l,用無(wú)菌水補(bǔ)足至10 μ l,輕輕混勻,室溫放置1 h,4℃過夜連接。

1.2.1.3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 取上述連接產(chǎn)物1 μ l加入100 μ l新鮮配制的E coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,即冰浴30 min,42℃熱休克90 s,即冰浴2 min后,加入 800 μ l預(yù)熱的 LB培養(yǎng)液中,37℃220 rpm/振搖1 h。12 000 rpm/離心 5 min,棄上清剩余約100 μ l菌液,混勻,用L型玻棒均勻涂布于含Amp+/IPTG/X-Gal的篩選平板,37℃培養(yǎng)過夜,同時(shí)設(shè)定未轉(zhuǎn)化菌作為陰性對(duì)照。

1.2.1.4重組質(zhì)粒的鑒定 挑取經(jīng)Amp/IPTG/XGal抗性篩選出的白色轉(zhuǎn)化的菌落,與LB培養(yǎng)液(含有Amp+)中,進(jìn)行小量增菌,37℃220 rpm/振搖過夜。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR,T-A克隆陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒,送寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將鑒定好的重組質(zhì)粒,測(cè)A值,計(jì)算出原始拷貝數(shù),然后按比例稀釋成1011-101拷貝數(shù)/ml濃度梯度,加入25 μ l反應(yīng)體系,置實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min,95℃變性25 s,60℃退火30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在計(jì)算機(jī)上自動(dòng)形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立 在 25 μ l反應(yīng)體系中,PCR Master Mix(包括10×PCR緩沖液,MgCl2,dNTP,DNA 聚合酶等)12.5 μ l,上、下游引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ l,探針(10 μ mo1/L)0.5 μ l,DNA模板 0.5 μ l,用滅菌重蒸水補(bǔ)足 25 μ l。熒光定量PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min,95℃變性25 s,60℃退火30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.4沙門氏菌熒光定量PCR方法實(shí)驗(yàn)條件的驗(yàn)證

1.2.4.1特異性實(shí)驗(yàn) 分別以傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌、福氏痢疾志賀氏菌、腸球菌制備模板,用所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

1.2.4.2敏感性實(shí)驗(yàn) 將制備的沙門氏菌重組質(zhì)粒,利用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度并換算為拷貝數(shù),用無(wú)菌水10倍系列稀釋,每個(gè)稀釋度取2 μ l作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,測(cè)定其最低檢測(cè)值。

1.2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3種不同濃度(1010、107和104)沙門氏菌重組質(zhì)粒,經(jīng)重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),觀察沙門氏菌熒光定量PCR擴(kuò)增體系的重復(fù)性效果。

1.2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將自制的沙門氏菌熒光定量擴(kuò)增體系混合后分裝,-20℃冷凍保存,定期取出檢測(cè)。

1.2.4.5模擬標(biāo)本的檢測(cè) 將沙門氏菌制備一定濃度的菌懸液,分別加入到1%的奶粉生理鹽水中混勻,應(yīng)用裸磁粒子吸附奶粉中的沙門氏菌后提取模板DNA,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,同時(shí)以分離培養(yǎng)作對(duì)照。

1.2.4.6臨床糞便標(biāo)本的檢測(cè) 將可疑的糞便標(biāo)本約1 g于15 ml無(wú)菌離心管中,加10ml無(wú)菌生理鹽水,充分振蕩混勻,應(yīng)用裸磁粒子吸附糞便中的沙門氏菌后提取模板DNA,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,同時(shí)以分離培養(yǎng)作對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒購(gòu)建結(jié)果從沙門氏菌基因組DNA,用傷寒沙門氏菌擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳獲得約119 bp大小片段(圖1)。產(chǎn)物純化回收后將產(chǎn)物克隆至載體,提取質(zhì)粒酶切后送Takara公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果證明擴(kuò)增片段與序列完全相符。

2.2沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將制備的沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,按原液、101-1011濃度進(jìn)行稀釋,采用本文所建立的熒光定量擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度在104-1010可形成較為理想的擴(kuò)增曲線(圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。

2.3最低檢測(cè)限結(jié)果將標(biāo)準(zhǔn)品原液作梯度稀釋成101-109拷貝/ml,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示本方法最低檢測(cè)限為103拷貝/ml,相當(dāng)于100個(gè)菌細(xì)胞。

2.4特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果以傷寒沙門氏菌和6種其它細(xì)菌制備的基因組DNA為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果除沙門氏菌外,其他6種相關(guān)細(xì)菌均響應(yīng)(圖4),證實(shí)有較好的特異性。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果將-20℃冷凍保存的沙門氏菌熒光定量擴(kuò)增體系,以104、107、1010重組質(zhì)粒為模板,分別在1周、1個(gè)月到6個(gè)月間分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,結(jié)果在6個(gè)月內(nèi)三種重組質(zhì)粒的測(cè) 定CT值無(wú)明顯的變化(表1)。

圖1 沙門氏菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖

圖3 沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 沙門氏菌熒光定量擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)3種1010、107和104濃度沙門氏菌重組質(zhì)粒,經(jīng)重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果,1010循環(huán)閥值分別為:20.59、21.05,平均閥值為:20.82±0.33,變異系數(shù)為:1.56%,;107循環(huán)閥值分別為:31.40、31.37平均閥值為:31.39±0.02,變異系數(shù)為:0.07%;104循環(huán)閥值分別為:39.40、39.88,平均閥值為:39.14±0.37,變異系數(shù)為:0.94%,顯示具有良好的重復(fù)性。

2.7模擬感染標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果取10份模擬污染奶粉標(biāo)本,分別采用熒光定量PCR法和分離培養(yǎng)法進(jìn)行同步檢測(cè),結(jié)果二種方法均能對(duì)奶粉中的沙門氏菌進(jìn)行有效檢出,二者符合率為100%。

2.8臨床標(biāo)本的檢測(cè)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和分離培養(yǎng)法分別對(duì)35份糞便標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè),結(jié)果:熒光定量PCR法陽(yáng)性16份,陽(yáng)性檢出率為:45.7%;分離培養(yǎng)法陽(yáng)性14份,陽(yáng)性檢出率:40.0%。結(jié)果顯示,熒光定量PCR法和分離培養(yǎng)法均能對(duì)糞便標(biāo)本中的沙門氏菌進(jìn)行有效的檢出,而熒光定量PCR法快速(4 h)與分離培養(yǎng)法(3-4天)相比時(shí)間大為縮短。

3 討論

熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)發(fā)展起來的一種新的核酸定量技術(shù),PCR檢測(cè)沙門氏菌的特異性,取決于所選擇的擴(kuò)增靶序列是否為沙門氏菌高度保守的特異性片斷,能否忠實(shí)地?cái)U(kuò)增靶序列,由人工合成的一對(duì)寡核苷酸引物和探針序列決定。反之,引物設(shè)計(jì)又取決于沙門氏菌是否具有顯著特征的屬或種特異性靶序列,顯然靶序列的選擇和引物和探針的設(shè)計(jì)是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。目前用于沙門氏菌PCR檢測(cè)的基因主要有:agfA、fimA、iagAB、IS200、invA、iroB、mkfA、ompC 和viaB 等基因[3-6]。但某些基因存在一些問題,如采用IS200會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性,會(huì)擴(kuò)增志賀氏菌等,采用invA基因還可造成假陰性或漏檢,而且它還會(huì)擴(kuò)增一些非沙門氏菌,造成假陽(yáng)性。另外,上述有些基因只適用于檢測(cè)某些沙門氏菌,而非沙門氏菌屬,顯然也不應(yīng)采用。沙門氏菌fimY基因序列與Gen Bank網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的所有物種核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)的結(jié)果,以及生物信息學(xué)方法證明,該基因在沙門氏菌內(nèi)高度保守,而相對(duì)于其它物種則具有高度特異性。所以采用沙門氏菌fimY基因序列設(shè)計(jì)沙門氏菌檢測(cè)的特異引物和探針更具特異性和實(shí)用性[7,8]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法學(xué)建立的關(guān)鍵是要有可靠穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品,為保證所建立方法的準(zhǔn)確性和可靠性,本研究首先成功構(gòu)建沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,并對(duì)方法學(xué)建立的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索。結(jié)果顯示,利用本研究所設(shè)計(jì)的引物和探針建立的擴(kuò)增體系,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增對(duì)沙門氏菌和其它相關(guān)細(xì)菌的檢測(cè)證實(shí)具有較好的特異性;敏感性檢測(cè)結(jié)果分析顯示,本方法的最低檢測(cè)限為103拷貝/ml,相當(dāng)于100 cfu/ml;并具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法快速檢測(cè)沙門氏菌,不僅能快速檢測(cè)食(乳)品中的沙門氏菌,還可直接用于臨床糞便中沙門氏菌的診斷。

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