周子珊, 束長龍, 梁革梅, 蒼 晶, 宋福平, 張 杰**

(1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,哈爾濱 150030;2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是目前應用最廣泛的微生物殺蟲劑,其在形成芽胞時伴隨產(chǎn)生Cry蛋白,大部分Cry蛋白以130～140 ku原毒素的形式存在,在昆蟲腸道內(nèi)被消化成55～60 ku的活性片段[1],Cry蛋白具有3個典型的結構域[2]。孔洞形成模型認為：活化的蛋白與幼蟲中腸細胞上的初級受體(鈣黏蛋白,cadherin)相結合,使得另外一種蛋白酶更容易切除Cry毒素的N末端即Domain I的α-1螺旋[3-4],這引起毒素多聚體形式的聚集。多聚體增加了與次級受體(氨肽酶N,aMinopeptidase N)結合的親和力,寡聚體與次級受體結合后插入細胞膜,然后在中腸細胞膜上形成孔洞,引起滲透壓失衡,導致中腸細胞破裂,最終導致昆蟲死亡[2,5-6]。Cry蛋白在昆蟲體內(nèi)形成正確的寡聚體是能夠插入細胞膜的前提條件,但離體情況下,自發(fā)形成的寡聚體可能影響Cry毒素與初級受體和次級受體的結合,從而影響成孔能力,最終影響活性。

cry1Ah1 基因(專利號：ZL200410009918.9)是從天然Bt菌株BT8中分離克隆的新型殺蟲晶體蛋白基因,該基因全長 3 549 bps,編碼1182個氨基酸,表達蛋白為134 ku[7]。Cry1Ah蛋白對亞洲玉米螟、水稻二化螟和棉鈴蟲的活性比Cry1Ac分別高7倍、5倍和近5倍[8]。然而Cry1Ah蛋白活性片段殺蟲活性有不穩(wěn)定的現(xiàn)象,經(jīng)過純化分析發(fā)現(xiàn)Cry1Ah活化蛋白中存在寡聚體。本文研究了NaCl對Cry1Ah蛋白寡聚化的促進作用,發(fā)現(xiàn)寡聚體能降低對棉鈴蟲(Helicoverpa arMigera)的活性。因此,在今后進行Cry蛋白活性研究和轉cry基因植物[9]的構建過程中如何減少和避免體外寡聚化,將是BtCry蛋白除了高毒力之外應當引起足夠重視的因素。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胰蛋白酶購自Sigma公司;其他試劑為市售國產(chǎn)或者進口分析純或電泳級純化學試劑。

Beckman高速離心機Avanti J-26xp;德國臺式Eppendorf離心機 5415C;美國Bio-Rad公司 Mini p roteinⅢ蛋白電泳儀;瑞典法瑪西亞公司高效液相色譜系統(tǒng)AKTA Exp lorer 100。

1.2 菌株和載體

Bt重組菌株Biot1Ah,本實驗室構建[8],即由HD73無晶體突變株導入含有cry1Ah全長基因的重組質(zhì)粒pSXY 422b-1Ah。

1.3 Cry1Ah蛋白

Cry1Ah蛋白的提取參照Xue等的方法[8]。提取的Cry1Ah經(jīng)Brad ford法(Bio-Rad試劑盒,操作見廠家提供說明書)定量后,與胰蛋白酶按20∶1(質(zhì)量)的比例混合,37℃,消化1 h,SDS-PAGE檢測消化完全后,經(jīng)分子篩Surperdex75純化,緩沖液為50mmol/L Na2CO3,pH9.5,流速 1 ML/min,監(jiān)測A254和 A280,并收集各峰組分。

1.4 戊二醛交聯(lián)

戊二醛交聯(lián)試驗用以分析Cry蛋白寡聚化的程度。蛋白樣品中加入質(zhì)量濃度25%的戊二醛使其終濃度為2%,室溫反應2 min;加入固體 NaBH4終止交聯(lián),NaBH4∶戊二醛(摩爾數(shù))為 10∶1。然后,加入8μL 25%脫氧膽酸,和 25μL 78%的三氯乙酸[10],4℃,12 000 r/Min,離心10min,收集沉淀,超純水洗2～3次沉淀,最后將沉淀溶于50 mmol/L pH 10.0的Na2CO3中,加入1/2體積的3×Loading buffer,煮沸3 min,進行SDS-PAGE檢測。

1.5 生物活性分析

活化的Cry1Ah蛋白置于4℃儲存1個月后(4℃存放易于形成寡聚體),經(jīng)分子篩Superdex 75純化,分別收集洗脫峰Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白,濃縮定量后,進行對棉鈴蟲的毒力測定,生物測定方法參照Xue等的方法[8]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用POLO軟件計算LC50值,通過SPSS 11.5軟件進行顯著性差異檢測(p＜0.05水平)。

2 結果與分析

2.1 Cry1Ah蛋白

從Biot1Ah中提取的Cry1A h原毒素蛋白分子量為134 ku(圖1),經(jīng)胰蛋白酶消化1 h后,形成約60 ku的活性片段(圖2)。

圖1 Cry1Ah原毒素的 SDS-PAGE圖譜

圖2 經(jīng)胰蛋白酶活化后的Cry1Ah毒素SDS-PAGE圖譜

活化的Cry1Ah蛋白經(jīng)分子篩Superdex 75純化時出現(xiàn)3個峰(圖3),收集各洗脫峰,并進行SDSPAGE檢測結果表明,3個峰都只有60 ku的目的蛋白(圖4)。這一結果表明,活化的Cry1Ah在溶液中同時以3種分子量形式存在,推測是一種單體和兩種寡聚體。

2.2 NaCl對Cry1Ah寡聚化的影響

等量的Cry1Ah原毒素在胰蛋白酶消化時,添加不同終濃度的NaCl,消化完全后,經(jīng)分子篩Superdex 75檢測結果表明,隨著NaCl濃度的升高,單體吸收峰(吸光值)有所降低,而寡聚體的吸收峰有一定程度的升高(圖5),如峰Ⅲ(單體)的最大吸光值從83.8mAU(a)降至66.99 mAU(c),這說明在消化時加入一定濃度的NaCl,對Cry1Ah的寡聚化有促進作用。

2.3 戊二醛交聯(lián)試驗

戊二醛交聯(lián)試驗發(fā)現(xiàn)峰Ⅰ和Ⅱ除有60 ku的蛋白條帶外,分別檢測到3、4條分子量大于60 ku的蛋白條帶(圖6)。經(jīng)Quantity One軟件分析,峰Ⅱ寡聚體的4條帶總的相對含量占總蛋白的16.12%,峰I寡聚體的3條帶總的相對含量占總蛋白的63.35%,而峰Ⅲ只有60 ku的蛋白。這說明,活化的Cry1Ah蛋白,確實存在著寡聚化現(xiàn)象,而且寡聚體以多種形式存在,這一結果驗證了此前的推論。

2.4 對棉鈴蟲的生物活性分析

生物活性測定結果表明,活化的Cry1Ah對棉鈴蟲的毒力與原毒素、單體峰Ⅲ和寡聚體峰Ⅱ間差異不顯著(p＜0.05);而寡聚體峰I的毒力比活化的Cry1Ah蛋白和原毒素分別降低了49.6倍和31.9倍(差異顯著,p＜0.05),比單體峰Ⅲ和寡聚體峰Ⅱ分別降低了11.9倍和14.2倍(差異顯著,p＜0.05)。這一結果說明,活化的Cry1Ah蛋白形成寡聚體后對棉鈴蟲的毒力下降。

圖6 戊二醛交聯(lián)分析Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的SDS-PAGE圖譜

表1 Cry毒素對棉鈴蟲的生物活性測定

3 討論

與很多cry基因相似,cry1Ah1基因表達134 ku的原毒素,經(jīng)胰蛋白酶消化后,形成60 ku的活性片段,活性片段的生物活性與Cry1Ah原毒素毒力無顯著差異。

Cry蛋白的寡聚化已有報道[11-12],一般情況下Cry原毒素則不會形成寡聚體[13],而體外活化的Cry蛋白在溶液中存在著不同程度的寡聚化現(xiàn)象,如 Cry1Aa、Cry1Ac、C ry1C 、C ry1D 和 Cry3A 蛋白在溶液中以單體和多聚體的混合物形式存在,其中寡聚體呈現(xiàn)的分子量大于 600 ku[13-15]?；罨腃ry1Ie在溶液中能發(fā)生寡聚化[16],而寡聚化的Cry1Ie蛋白對于小菜蛾(P lutella xy lostella)2齡幼蟲的毒力下降了100倍。本研究中Cry1Ah在離體條件下可形成不同分子量的寡聚體,而且寡聚體的高含量的大分子對棉鈴蟲的毒力顯著下降。此外,NaCl可以加劇Cry1Ah活性片段在體外寡聚化程度,因此在研究Cry毒素過程中,應注意控制緩沖液的鹽濃度,減少寡聚體的形成。此外,存放時間、溫度和蛋白性質(zhì)與濃度等因素也都有可能影響寡聚化,將在今后的研究中對這些因素進行深入探索。

Soberón等人報道經(jīng)過分子設計的缺少α-1螺旋的Cry1A b和Cry1Ac,在體外沒有初級受體Cadherin的情況下也可以形成寡聚體,并且對Cadherin沉默的煙草天蛾(Manduca sexta)和Cadherin缺失突變的抗性棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)具有毒殺作用[17]。由此可見,形成正確的寡聚體對活性的影響十分重要。本研究的Cry1Ah(峰I組分)形成了占總蛋白的比例很高的、分子量較大的寡聚體分子,可能有部分基團被包裹在寡聚體的中心位置,影響與受體的識別和結合,另一方面可能由于沒有切除α-1螺旋,因而沒有形成完全正確的寡聚體形式,從而導致插膜的能力下降,毒力降低。因此,對寡聚體及其形成條件的研究為減少寡聚化程度提供有效方法,同時也為Cry1Ah蛋白在轉基因方面的成功應用奠定理論基礎。

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