秦碧霞, 蔡健和, 陸秀紅, 林 林, 廖富榮, 劉志明

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,南寧 530007; 2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,南寧 530007;3.廣西玉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,玉林 537000; 4.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局,廈門 361012)

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員,是葫蘆科重要病毒之一,1935年Ainsworth在英國首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道,隨著葫蘆科作物在各國間的交流引種日益頻繁,目前該病毒在英國 、希臘、羅馬尼亞、巴西 、日本 、伊朗 、印度、韓國等及中國部分地區(qū)均有分布[1-5],在一些地區(qū)已造成大田瓜類作物的毀滅性損失,嚴(yán)重威脅葫蘆科作物安全生產(chǎn)[3-4,6-7]。2006年我國農(nóng)業(yè)部(農(nóng)業(yè)部公告第788號)已將該病毒確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。

種子帶毒是黃瓜綠斑駁花葉病毒遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑,建立健全種子病毒檢測方法,了解種子攜帶病毒情況,對從源頭控制該病毒的擴(kuò)散蔓延有重要指導(dǎo)意義。血清學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測是快速診斷該病毒的主要方法,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)廣泛應(yīng)用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測,RT-PCR及免疫捕獲RT-PCR(IC-RT-PCR)的應(yīng)用使黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測靈敏度大大提高[8-9],Lee[10]等利用生物芯片技術(shù)使黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測更準(zhǔn)確和快捷,鄧叢良[11]等建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒方法,檢測靈敏度比RTPCR高10倍。ELISA和RT-PCR、IC-RT-PCR已被廣泛應(yīng)用于黃瓜綠斑駁花葉病毒帶毒種子的檢測[12-15]。本文通過生物學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)方法測定了感染黃瓜綠斑駁花葉病毒的葫蘆(Lagenaria siceraria)種子攜帶病毒的情況,并測定了種子各部位攜帶病毒的侵染活性及DAS-ELISA檢測葫蘆種子攜帶病毒的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 供試材料

檢測用種子是感染黃瓜綠斑駁花葉病毒并表現(xiàn)明顯癥狀的葫蘆植株留的種子,于2006年12月開瓜取種,經(jīng)洗凈曬干后保存在4℃冰箱備用,陽性對照為本實(shí)驗(yàn)室分離純化接種保存在葫蘆上的黃瓜綠斑駁花葉病毒,健康對照為健康葫蘆植株收取的種子。

1.2 種子帶毒率測定

1.2.1 苗期癥狀觀察法

2007年3月和6月分別在防蟲網(wǎng)室水泥池內(nèi)播種供試葫蘆種子150粒和100粒,觀察至5～6葉期,記錄發(fā)病株數(shù),統(tǒng)計(jì)發(fā)病率,并用ELISA方法檢測驗(yàn)證。

1.2.2 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)

CGMMV抗血清、酶標(biāo)抗體等購自美國Agdia公司。隨機(jī)取30粒供試葫蘆種子,每粒種子為1份樣品,將種子剝開后加1ML 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)和少量金剛砂研磨,低速離心取上清液進(jìn)行檢測,設(shè)感染CGMMV的葫蘆葉片做陽性對照,健康葫蘆葉片和種子為陰性對照,檢測步驟及結(jié)果判斷參照試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR法(IC-RT-PCR)

根據(jù)黃靜等[12]設(shè)計(jì)的CGMMV基因組保守序列合成上下游特異引物,上游引物CGM1：5′-CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3′,下游 引物CGM2 ：5′-CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3′,擴(kuò) 增片段約 650 bp。AMV、RNasin、Taq DNA聚合酶、dNTPs等購自寶生物工程(大連)有限公司。

在0.2 ML PCR管中加入100μL用包被緩沖液稀釋至工作濃度的CGMMV抗血清,37℃孵育2～3 h,倒凈,PBST洗3次,每次 3 min,加入1.2.2制備的整粒種子研磨上清液100μL,37℃孵育2～3 h或4℃冰箱過夜,倒凈,PBST洗3次,ddH 2O洗1次,吸盡余液,向管中加入 DEPC水11.5μL,5×RT buffer 4μL,dNTPs(10 mmoL/L)2μL,下游引物 CGM2(100μmol/L)1.0μL,混勻后 82 ℃4Min,迅速置冰上 3 min,加入 AMV(5U/μL)1.0μL,RNasin(40 U/μL)0.5 μL,總體積 20μL,混勻后42℃80Min,85℃10min。

PCR反應(yīng)總體積20μL：ddH2 O 14.7μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL,10×PCR bu ffer 2μL、10mmoL/L dNTPs 0.2 μL、CGM1(10 μmol/L)、CGM2(10μmol/L)各1.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.1μL,混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1min,循環(huán)35次,最后72℃延伸10 Min,用1.2%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 種子不同部位病毒檢測

分別取整粒種子、剝離的種皮及其對應(yīng)的種仁各10粒用于檢測,每粒為1份樣品。種子及種皮分別用1ML磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)浸泡2 h得到浸泡液,種仁加1 ML緩沖液研磨,低速離心后取上清液,分別用DAS-ELISA和IC-RT-PCR方法檢測帶毒情況。

1.4 DAS-ELISA檢測靈敏度

取1粒病種(0.16 g),加3.2 ML磷酸鹽緩沖液(pH 7.4),研磨后低速離心取上清液,按倍比法系列稀釋至 40、80、160、320、640、1 280 、2 560、5 120、10 240倍,用DAS-ELISA檢測,用安托斯全自動酶標(biāo)儀(Anthos 2010)讀取405 nm吸光值,根據(jù)待測樣品與陰性對照的吸光值比值判斷結(jié)果。出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最大稀釋度即該法檢測靈敏度。

1.5 種子攜帶病毒的侵染活性

分別取1.3制備的整粒種子表面(種表)、種皮浸泡液、種仁及整粒種子研磨上清液各接種葫蘆8株,觀察記錄發(fā)病情況,并用ELISA檢測驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子帶毒率測定

苗期癥狀觀察法播種的兩批種子分別成苗110株和89株,觀察至6葉期,各有1株表現(xiàn)花葉癥狀,平均發(fā)病率為1.01%,經(jīng)DAS-ELISA檢測,顯癥植株與CGMMV抗血清呈陽性反應(yīng),隨機(jī)抽取10株無癥狀植株進(jìn)行檢測,均與CGMMV抗血清呈陰性反應(yīng),未發(fā)現(xiàn)隱癥帶毒植株。葫蘆種子攜帶CGMMV從種子到幼苗的傳毒率為1.01%。

DAS-ELISA法檢測結(jié)果表明,隨機(jī)抽檢的30粒病株種子全部與CGMMV抗血清呈陽性反應(yīng),健康種子呈陰性反應(yīng),感病葫蘆種子帶毒率100%。

IC-RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測,30份病株種子及陽性對照均擴(kuò)增出約650 bp片段,與預(yù)期片段大小一致,健康對照無任何擴(kuò)增條帶(圖1),與DAS-ELISA檢測結(jié)果一致,感病葫蘆種子帶毒率100%。

圖1 帶毒葫蘆種子IC-RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 種子不同部位病毒檢測

DAS-ELISA檢測結(jié)果表明：10份種皮浸泡液及9份種仁研磨上清液與CGMMV抗血清呈陽性反應(yīng),1份種仁上清液及10份種表浸泡液與CGMMV抗血清呈陰性反應(yīng);IC-RT-PCR檢測結(jié)果：種表浸泡液無預(yù)期片段擴(kuò)增,種皮浸泡液及種仁研磨上清液均出現(xiàn)約650 bp預(yù)期片段(表1)。在抽檢的10粒種子中,種子表面未檢出CGMMV,種皮及種仁均檢測到CGMMV。

表1 帶毒種子不同部位檢測結(jié)果

2.3 DAS-ELISA檢測靈敏度

從表2看出,種子研磨上清液最大稀釋至5 120倍仍與CGMMV抗血清呈陽性反應(yīng),相當(dāng)于可以檢測31.25μg帶毒種子攜帶的CGMMV。

表2 種子研磨上清液不同稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果1)

2.4 種子攜帶病毒的侵染活性

種表浸泡液接種的8株葫蘆均生長正常,未表現(xiàn)任何癥狀,而種皮浸泡液、種仁及整粒種子研磨上清液分別接種的8株葫蘆,各有6、5株和7株表現(xiàn)脈綠、斑駁花葉等典型CGMMV侵染癥狀,對顯癥與不顯癥的植株進(jìn)行ELISA檢測,結(jié)果與癥狀表現(xiàn)一致,說明種子各部位攜帶的CGMMV具有侵染活性。

3 結(jié)論與討論

ELISA和IC-RT-PCR隨機(jī)抽檢 30粒感染CGMMV的葫蘆植株種子帶毒率為100%,播種出苗的199粒種子傳毒率只有1.01%。Choi Gug-Seoun[16]檢測感染CGMMV的葫蘆種子帶毒率為84%,傳毒率為2%。由于種子傳毒與否及種傳率高低除與病毒本身有關(guān)外,還受植株品種、感染時(shí)期、環(huán)境條件及各種因素互作影響[17],因此不同批次的同品種種子帶毒率和傳毒率也不同,隨機(jī)取樣和抽取足量樣本進(jìn)行檢測更能真實(shí)反映種子的帶毒情況。有研究認(rèn)為甘蔗花葉病毒(SCMV)存在于玉米種皮和胚乳中的病毒不是導(dǎo)致幼苗發(fā)病的主要原因,胚攜帶的病毒才是導(dǎo)致種子傳毒的內(nèi)在因素[18]。本研究在葫蘆種子表面未檢出CGMMV,可能是由于檢測的樣品少,或者表面病毒量少未能檢出。葫蘆種皮和種仁經(jīng)檢測攜帶CGMMV,但未對具體的帶毒部位做進(jìn)一步檢測,CGMMV在葫蘆種子上的傳毒率與種子各部位攜帶病毒的關(guān)系及其傳毒機(jī)理尚需進(jìn)行更深入系統(tǒng)的研究。

種子傳毒對病害的流行傳播有重要影響,雖然至今未明確CGMMV的田間傳毒媒介,但該病毒極易通過汁液摩擦、葉片接觸、嫁接、農(nóng)事操作等非介體傳播[19],一旦田間出現(xiàn)因種子帶毒發(fā)生的病苗,即使是很低的比例,也會以此為初侵染源,通過非介體因素傳播開來,從而造成嚴(yán)重?fù)p失。此外,葫蘆是我國很多西瓜產(chǎn)區(qū)用于嫁接防治枯萎病的主要砧木,葫蘆種子帶毒很容易通過嫁接傳染接穗西瓜苗,從而擴(kuò)散到大田引起嚴(yán)重的后果[3]。

CGMMV是我國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物和進(jìn)境檢疫性有害生物,由于該病毒極強(qiáng)的穩(wěn)定性、具有廣泛的適宜寄主和多種傳播特性,在我國定殖和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)性極高[20]。DAS-ELISA和 RT-PCR(IC-RT-PCR)等方法已經(jīng)成功應(yīng)用于快速靈敏檢測種子攜帶的 CGMMV[12-15],本研究表明 DASELISA檢測葫蘆種子CGMMV的靈敏度為1/5120種子研磨液。種子攜帶病毒的滅活處理也已經(jīng)有很多成功的方法[13-14],當(dāng)務(wù)之急是加強(qiáng)葫蘆科種子檢驗(yàn)檢疫規(guī)程制定和監(jiān)管,對商品用種和引進(jìn)調(diào)運(yùn)的種子進(jìn)行消毒處理,加強(qiáng)抗病品種培育等,多途徑阻斷該病毒的傳入、定殖及擴(kuò)散危險(xiǎn),促進(jìn)葫蘆科作物生產(chǎn)持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展。

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