于溯洋 柳磊 李普

心肌纖維化重構(gòu)主要指心肌細(xì)胞外間質(zhì)內(nèi)膠原含量或容積分?jǐn)?shù)顯著增高，是擴(kuò)張型心肌病的主要組織病理學(xué)改變［1，2］。心肌成纖維細(xì)胞是心臟的主要間質(zhì)細(xì)胞，其分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原構(gòu)成心肌間質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的基本結(jié)構(gòu)。心肌成纖維細(xì)胞的功能及結(jié)構(gòu)改變?cè)谛募±w維化發(fā)展過(guò)程中起十分重要的作用。哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)控因子，可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外間質(zhì)膠原蛋白的合成代謝影響器官纖維化進(jìn)程。真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)是 mTOR的下游底物，當(dāng)生長(zhǎng)信號(hào)激活mTOR后，eIF-4E脫落，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯［3］，eIF-4E通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的輸出速度而影響細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。我們通過(guò)觀察擴(kuò)張性心肌病大鼠心肌組織中mTOR和eIF-4E的mRNA表達(dá)變化及與心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)相關(guān)性，探討mTOR信號(hào)通路在擴(kuò)張性心肌病大鼠心肌纖維化過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2周齡Wistar大鼠30只，雌雄各15只，體重(64±6)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。對(duì)所有大鼠進(jìn)行編號(hào)，并隨機(jī)分為擴(kuò)張性心肌病模型組(DCM組)和對(duì)照組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備:阿霉素是一種高效、廣譜抗腫瘤蒽醌類藥物，由于阿霉素與心肌組織的親和力明顯高于其他組織，因此有嚴(yán)重的心臟毒性，利用阿霉素制作擴(kuò)張性心肌病的模型是已得到公認(rèn)的廉價(jià)、簡(jiǎn)單、實(shí)用的方法［4］。DCM組大鼠模型建立及標(biāo)本制作:按體重2.5 mg/kg劑量尾靜脈注射阿霉素(浙江海正藥業(yè))，每周2次，連續(xù)6周，總劑量30 mg/kg。對(duì)照組注射相同體積的注射用水。喂養(yǎng)到第6周時(shí)以10%水合氯醛麻醉后，剪去胸毛，經(jīng)超聲多譜勒儀取二尖瓣長(zhǎng)軸切面行心動(dòng)圖檢測(cè)各大鼠左心室結(jié)構(gòu)和心功能參數(shù):包括左心室舒張期末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮期末內(nèi)徑(LVESD)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室內(nèi)徑縮短率(FS)等。共取15個(gè)心動(dòng)周期平均所得數(shù)作為測(cè)量值;然后處死大鼠，剪取左心室游離壁心肌組織0.9%氯化鈉溶液沖洗并除去脂肪后分為2塊，1塊液氮保存用于檢測(cè)mRNA，1塊10%甲醛溶液固定用于苦味酸-天狼星紅染色后行膠原容量分析。

1.2.2 病理學(xué)檢測(cè):標(biāo)本用中性10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)行天狼星紅染色:①經(jīng)10%甲醛固定的組織取材大小1 cm×1 cm×0.2 cm;②病理常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋;③石蠟切片厚度4 μm;④二甲苯脫蠟至水洗;⑤置0.1%苦味酸天狼星紅染液中1 h;⑥自來(lái)水流水沖洗4 min;⑦染Harris’s蘇木素5 min;⑧各級(jí)濃度乙醇內(nèi)脫水;⑨二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片;⑩在偏振光顯微鏡下觀察。并用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)分析膠原容積積分(PCV)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè):Trizol法提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。分別抽提對(duì)照組和DCM組成纖維細(xì)胞的總RNA。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。GAPDH:上 游 5 ＇-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ＇，下 游 5 ＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度452 bp。mTOR引物:上游 5＇AAGATGCTTGGGACAGGC3＇，下游 5＇GGTCCGAAGGTAGTTGG3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 343 bp;p70S6K 引物:上游 5＇TTTTGGCTCGGAAGGTGG3＇，下游 5＇TGTCGGATTGGAAGTGGC3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度421 bp;電泳圖象以GelprO4版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，其代表數(shù)值為平均光密度值，代表相應(yīng)基因的表達(dá)量。并除以GAPDH的平均光密度值，所得數(shù)值作為各擴(kuò)增產(chǎn)物的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組選模資料 DCM組15只大鼠中，1只大鼠死亡，14只成模;成模大鼠出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病病理改變。對(duì)照組15只大鼠無(wú)死亡。

2.2 2組大鼠超聲心動(dòng)圖比較 與對(duì)照組比較，DCM組LVEDD、LVESD 明顯增加(P＜0.05)，LVEF、FS明顯降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比較

表1 2組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比較

組別 LVEDD(cm) LVESD(cm) FS(%) LVEF(%)0.53± 0.29 0.30±0.18 36.4± 2.6 71.5±1.2 DCM 組(n=14) 0.61±0.03 0.37±0.05 28.6±4.1 61.5±6.1 P值對(duì)照組(n=15)0.030 0.028 0.037 0.028

2.3 天狼星紅染色PCV檢測(cè)結(jié)果 天狼星紅染色及膠原容積積分結(jié)果:天狼星紅染色，正常小鼠心肌膠原纖維主要分布在血管周圍，心肌細(xì)胞間有少量的膠原纖維;DCM組除血管周圍有膠原纖維外。心肌細(xì)胞間有大量縱橫交錯(cuò)的膠原纖維，排列紊亂，膠原纖維的量要明顯多于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 2組PCV比較

表2 2組PCV比較

組別 PCV(%)1.51±0.31 DCM 組(n=14) 3.36±0.75 P值對(duì)照組(n=15)0.015

圖1 心肌膠原形態(tài)特征及分布(偏振光顯微鏡×100)

2.4 左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達(dá)結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增后，DCM組mTOR mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，經(jīng)光密度值分析，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的(1.8±0.08)倍(P＜0.05);DCM組eIF-4EmRNA的表達(dá)量較對(duì)照組亦明顯增加。經(jīng)光密度度值分析，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的(1.97±0.06)倍(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組大鼠左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達(dá)比較

表3 2組大鼠左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達(dá)比較

組別0.0036 0.00510.38±0.03 0.73±0.07 DCM 組 0.68±0.03* 0.87±0.03*P值mTOR eIF-4E對(duì)照組

3 討論

擴(kuò)張型心肌病的主要組織病理學(xué)改變?yōu)樾募〖?xì)胞凋亡和心肌細(xì)胞外間質(zhì)纖維化病變。目前所關(guān)注的各種致纖維化因子有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子家族(MMPs/TIMPs)等，但心肌組織受到這些細(xì)胞因子作用后調(diào)控纖維化形成的具體信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍不完全清楚。本結(jié)果顯示擴(kuò)張性心肌病大鼠模型其mTOR和eIF-4E的mRNA表達(dá)明顯增加，并且DCM組織膠原容積(CVF)同時(shí)明顯升高。結(jié)果提示mTOR/eIF-4E信號(hào)通路激活在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮一定作用。

mTOR整合來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)外的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子、能量和環(huán)境壓力等信號(hào)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原蛋白的合成代謝影響器官纖維化進(jìn)程。在心、肝、肺、腎、皮膚等器官的纖維化疾病過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)了mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，阻斷mTOR可以抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，減輕甚至逆轉(zhuǎn)器官纖維化，因而抑制該信號(hào)通路已成為防治器官組織纖維化靶向治療的熱點(diǎn)［5－8］。Ikeda等［9］通過(guò)對(duì)心肌 LKB1 基因敲除激活 mTOR 信號(hào)通路的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，mTOR及其下游調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)增加，最終導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原成分增多、纖維化，心房、心室直徑擴(kuò)大心功能惡化。Gao等［10］在束扎大鼠大動(dòng)脈建立的鼠心肌肥厚模型中發(fā)現(xiàn)阻斷mTOR信號(hào)通路可明顯改善模型動(dòng)物的心肌肥厚和纖維化，并且顯著改善心肌肥厚纖維化所致的心功能惡化。以上研究成果證實(shí)了mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路與各種原因所致器官纖維化疾病之間的關(guān)聯(lián)。而本研究結(jié)果從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平證實(shí)mTOR/eIF-4E信號(hào)通路激活在擴(kuò)張型心肌病心肌纖維化的進(jìn)程中通過(guò)調(diào)控心肌間質(zhì)膠原水平對(duì)心肌纖維化進(jìn)程發(fā)揮重要作用。

然而，雷帕霉素對(duì)擴(kuò)張性心肌病的干預(yù)是否可以調(diào)控mTOR通路進(jìn)而阻斷心肌纖維化的進(jìn)程，從而為擴(kuò)張性心肌病的有效治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)，尚需我們進(jìn)一步研究。

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