張超凡，黃艷嵐，周 虹，易九紅

（湖南省作物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛(wèi)星DNA和短串聯(lián)重復(fù)，可依據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，再根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計(jì)算等位基因頻率。SSR標(biāo)記缺點(diǎn)是引物開(kāi)發(fā)難度大，但由于是共顯性標(biāo)記，具有用量少，數(shù)量豐富、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[1]。目前，SSR 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于水稻[2-4]、小麥[5-6]、玉米[7]、大豆[8]、油菜[9-10]等的遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)來(lái)自湖南31份甘薯品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系鑒定，目的在于探討湖南甘薯地方品種與育成品種之間的遺傳多樣性，為進(jìn)一步分析湖南甘薯遺傳多樣性提供可靠的標(biāo)記手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本研究所用甘薯材料取自湖南省作物研究所，包括11份育成品種和20份地方品種（表1），均來(lái)自于湖南省。

1.1.2 試 劑 SSR引物如表2所示，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。Taq DNA聚合酶（2.5 U/mL）和DNA Marker購(gòu)自天根生化有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組的提取 DNA取頂部展開(kāi)新鮮葉片3～4片，置已編號(hào)保鮮袋中，采用CTAB[11]法對(duì)甘薯幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA提取。

1.2.2 SSR分析 SSR的PCR擴(kuò)增體系：2μL的10×PCR Buffer，2.5 μL 的 2.0 mM dNTPs，50 ng 甘薯DNA，1U Taq酶，2μL的5 mM引物（對(duì)），加ddH2O至20μL。SSR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min；然后進(jìn)行以下35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，58℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，最后72℃充分延伸7min。PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH 8.0，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯腈）變性后自然冷卻，用5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色，并拍照保存。

表1 本研究所用的品種名稱

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 膠板晾干后在燈箱上讀帶。統(tǒng)計(jì)方法參照文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

對(duì)SSR分子標(biāo)記分析的12對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物對(duì)SSR11電泳結(jié)果如圖1所示，共檢測(cè)出74等位基因位點(diǎn)，每對(duì)引物檢測(cè)出的等位基因位點(diǎn)3～10個(gè)，平均為6個(gè)。其中引物SSR7擴(kuò)增的等位基因位點(diǎn)最多，為10個(gè)，引物SSR12擴(kuò)增的等位基因位點(diǎn)最少，為3個(gè)。

表2 SSR引物組合及擴(kuò)增條帶

圖1 SSR引物組合SSR11對(duì)31個(gè)甘薯品種的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 甘薯品種間的遺傳差異

用SSR標(biāo)記對(duì)31份甘薯品種進(jìn)行了聚類分析，供試材料的遺傳距離為0.272 7～0.626 9，平均0.520 4，表明供試材料之間遺傳多樣性豐富，遺傳差異大。根據(jù)甘薯SSR標(biāo)記分析，對(duì)供試材料進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖2）。從聚類圖可以看出，湘78-150與湘薯12號(hào)的遺傳距離最近。

圖2 基于SSR標(biāo)記得到的31份甘薯品種的聚類圖

2.3 甘薯地方品種與育成品種遺傳差異分析

經(jīng)過(guò)遺傳距離計(jì)算，20份湖南地方品種遺傳距離為 0.288 1～0.814 8，平均 0.524 0；11 份育成品種遺傳距離為0.272 7～0.894 7，平均0.511 5。兩類材料平均遺傳距離大小為GDMC>GDL。湖南甘薯地方品種與湖南育成品種的遺傳距離0.288 1～0.7037，平均 0.516 7。

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)可以不受環(huán)境、發(fā)育時(shí)期、不同器官等的限制，從基因組水平上揭示遺傳變異程度。利用SSR標(biāo)記進(jìn)行研究時(shí)，需要知道研究材料兩端的序列信息，開(kāi)發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高，使得其在甘薯遺傳多樣性研究中受到限制。研究利用SSR方法分析31份湖南甘薯地方品種與育成品種的遺傳多樣性，擴(kuò)增的等位基因位點(diǎn)豐富。聚類圖上可以看出湘薯10號(hào)與湘薯6號(hào)的親緣關(guān)系較近；湘薯17號(hào)與湘薯86-75親緣關(guān)系較近，這與它們的系譜圖相吻合，說(shuō)明SSR標(biāo)記適用于檢測(cè)甘薯的遺傳多樣性。

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