国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

菊苣航天誘變材料RAPD分析及高產(chǎn)品系篩選

2011-06-08 07:52韓永芬盧欣石舒健虹付薇陸瑞霞覃濤英
草業(yè)學(xué)報(bào) 2011年5期
關(guān)鍵詞:菊苣草業(yè)類群

韓永芬,盧欣石,舒健虹,付薇,陸瑞霞,覃濤英

(1.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院草業(yè)科學(xué),北京100083;2.貴州省草業(yè)研究所,貴州 貴陽550006)

菊苣(Cichoriumintybus)為多年生草本植物,是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用牧草,原產(chǎn)于地中海、中亞和北非。菊苣在國外主要用于蔬菜和制糖原料及咖啡代用品。目前,我國登記了2個(gè)菊苣品種普那菊苣、將軍菊苣,均為引進(jìn)品種。普那菊苣(Cichoriumintybuscv.Puna)是20世紀(jì)80年代新西蘭科工部草地研究所培育出的菊苣飼用新品種,1985年正式鑒定通過并推廣利用[1],貴州省草業(yè)研究所1997年從新西蘭引進(jìn)種植,通過引種馴化,并對(duì)其進(jìn)行選育研究,于2005年9月通過貴州省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定命名為黔引普那菊苣,現(xiàn)已在生產(chǎn)中大量推廣應(yīng)用。

Damato[2]1991-1993年研究了播種期、種植密度對(duì)菊苣種子產(chǎn)量的影響,研究結(jié)果表明,意大利半島11月或3月播種,密度以11.1株/m2效果較好,種子產(chǎn)量可達(dá)639kg/hm2。新西蘭Hume等[3]1986-1995年對(duì)利用普那菊苣建植的混播草地進(jìn)行了綿羊放牧利用研究,設(shè)計(jì)了不同混播組合、放牧頻率、利用年限等,在4年內(nèi)混播草地中普那菊苣所提供產(chǎn)草量在第1~3年增加,第4年減少,提供干物質(zhì)占混播草地的34%,80%,85% 和57%,普那菊苣、高羊茅(Festucaarundinacea)、大網(wǎng)茅草(Bromuswillednowii,prairie grass)混播是比較好的組合。Boyd和Rogers[4]1997-2003年對(duì)普那菊苣的耐鹽性進(jìn)行了研究,認(rèn)為在200mmol/L NaCl濃度下,仍生長良好。國內(nèi)主要是在引種的基礎(chǔ)上開展相關(guān)研究,熊先勤等[5]研究了菊苣的生長發(fā)育規(guī)律,韓永芬等[6]對(duì)普那菊苣高產(chǎn)配套栽培技術(shù)、不同刈割利用方式進(jìn)行了研究,左相兵等[7,8]對(duì)飼喂肉兔、三元雜交豬進(jìn)行了試驗(yàn),劉鳳霞等[9]對(duì)菊苣種子生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行了研究,孫變姿等[10]對(duì)菊苣葉提取物對(duì)粘蟲的生物活性進(jìn)行了研究,研究對(duì)象均為引進(jìn)品種,沒有具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種。

在菊苣遺傳多樣性研究方面國外有部分相關(guān)報(bào)道,Van Cutsem等[11]采用擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性(AFLP)標(biāo)記對(duì)菊苣野生種和栽培種之間的基因流動(dòng)進(jìn)行了研究;Baes和Van Cutsem[12,13]用同工酶,Kiers等[14]及Koch和Jung[15]用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)和AFLP標(biāo)記說明菊苣栽培種中存在著豐富的遺傳多樣性;國內(nèi),羅燕等[16]利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同地理類群的菊苣材料進(jìn)行了研究,相同或相似地理來源和氣候類型的材料能基本聚在一起,說明遺傳多樣性與地理來源和氣候類型有一定的關(guān)系,而在菊苣誘變材料之間的研究沒見相關(guān)報(bào)道。

航天誘變?cè)谲俎#∕edicagosativa)、紅豆草(Onobrychistaneitica)、沙打旺(Astragalusadsurgens)等豆科牧草上有所應(yīng)用,并表現(xiàn)出較好的誘變效果[17]。該研究通過對(duì)2006年實(shí)踐八號(hào)育種衛(wèi)星搭載返回的黔引普那菊苣種子為選育材料,經(jīng)幾代選育后培育出的新品系進(jìn)行形態(tài)特征比較、RAPD分析及生產(chǎn)性能研究,創(chuàng)造出生產(chǎn)性能好具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品系,彌補(bǔ)國內(nèi)菊苣依賴進(jìn)口,缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的空白,為菊苣新品種選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

同時(shí)種植2006年航天搭載的黔引普那菊苣材料和地面對(duì)照種子,篩選優(yōu)良的突變材料。SP1代生長期間調(diào)查出苗率、存活率、株高、花序長、畸變株率和不育株率等,并與對(duì)照植株進(jìn)行比較,淘汰白化苗、畸變株等。其余正常株孕蕾后套袋,單株收種,將每序脫?;旌掀饋恚米鳛镾P2代的篩選材料。生長期間在群體中進(jìn)行觀察調(diào)查,以發(fā)現(xiàn)有利變異植株。收獲前再根據(jù)育種目標(biāo)對(duì)入選脫粒時(shí)結(jié)合考種,淘汰性狀不良的單序,并分單株進(jìn)行篩選,入選單株分別收獲脫粒,分別裝代編號(hào),作為播種SP3代的材料,目前選育到SP4代,獲變異材料27份,現(xiàn)表現(xiàn)較穩(wěn)定,另加上PA-57(黔引普那菊苣)和PA-36(將軍),共計(jì)材料29份。試驗(yàn)材料于2009年9月12日種植于貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山試驗(yàn)基地,取樣進(jìn)行RAPD分析的時(shí)間為2010年3月4日。

1.2 誘變品系的RAPD分析

1.2.1 DNA的提取 采用寶生物工程(大連)有限公司(TakaRa)植物基因組DNA提取試劑盒。

1.2.2 引物的篩選及反應(yīng)體系 選2個(gè)DNA樣品作模板,對(duì)賽百勝公司的100個(gè)RAPD引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選,從中選取了15個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物,在29個(gè)種質(zhì)之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:反應(yīng)總體積為25μL,內(nèi)含10×buffer,MgCl21.5mmol/L,dNTPs 150μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,引物1μmol/L,模板30ng,在BIO-RAD公司生產(chǎn)的 MyCyclerTMPCR儀上進(jìn)行如下程序:92℃3min;92℃1min;35℃1min;72℃2min,循環(huán)45次;72℃延伸8min。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 用1×TBE緩沖液配制1.2%(W/V)的瓊脂糖凝膠,PCR擴(kuò)增結(jié)束后,在每個(gè)樣品中加入4μL電泳指示液(溴酚藍(lán)0.25%,蔗糖40%)混勻,每個(gè)泳道上樣22μL,選擇合適的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記(如1 000,750,500bp),在180V電泳2~3h,將凝膠浸于0.5μg/mL的EB溶液中染30~60min,用水清洗凝膠(約10min),在BioSensSC810系列凝膠成像系統(tǒng)上觀察,拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì) RAPD為顯性標(biāo)記,同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。將PCR擴(kuò)增的DNA電泳條帶作為位點(diǎn)記錄下來,若某個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物在一個(gè)樣品中出現(xiàn),記作“1”,未出現(xiàn)的記作“0”。原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件,利用NTSYS-pc計(jì)算遺傳相似系數(shù)(DICE系數(shù)),并且進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA,unweighted pair-group method with arithmetic means)聚類分析。

1.3 誘變品系的形態(tài)特征及生產(chǎn)性能研究

于2009年9月12日將29個(gè)品系種植于貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山試驗(yàn)基地,4個(gè)重復(fù),小區(qū)面積6m2,在蓮座期每小區(qū)取10株共40株觀察葉形、葉色(用草坪比色卡進(jìn)行分級(jí))、葉脈,并測(cè)量葉長和葉寬等。4個(gè)重復(fù)中留1個(gè)重復(fù)用于后期的生長觀察,另3個(gè)重復(fù)用于鮮草產(chǎn)量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣RAPD多態(tài)性

15個(gè)RAPD隨機(jī)引物在供試材料中共擴(kuò)增出78條帶,擴(kuò)增片斷大小從100bp到2 000bp(圖1),其中63條具有多態(tài)性,總的多態(tài)性條帶比率PPB(number of polymorphic bands)為87.77%,平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.2條帶(表1)。進(jìn)一步比較各個(gè)引物的PPB值,有9個(gè)引物的多態(tài)性條帶比率在80.00%以上,其中引物SA10、SB2、SC3、SC4、SC10、SC13的多態(tài)性比率達(dá)100%。

2.2 菊苣遺傳相似系數(shù)

將擴(kuò)增所得到的78條片段在NTSYS-pc下計(jì)算材料間的遺傳相似系數(shù)(GS值)(表1)。GS值的變化范圍為0.60~0.91?;谶z傳相似系數(shù),利用UPGMA法對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析,在聚類圖(圖2)上品系PA-186單成1支,與其他材料之間的相似性較低;剩下的28份菊苣材料的相似性較高,集中為0.69~0.80,其中PA-51、PA-46又各單成1支,與其他材料之間的相似性較低。所選的29份菊苣材料中相似性最高的是PA-92和PA-26,相似性系數(shù)高達(dá)0.91,相似性最低的是PA-196和PA-18,PA-43和PA-41,兩者之間的相似系數(shù)為0.60。

如果以0.74為參照值,29份菊苣材料可以分為6個(gè)類群,PA-57、PA-62、PA-92、PA-26、PA-52、PA-89、PA-36、PA-11、PA-93、PA-33為 1 個(gè) 類 群;PA-45、PA-95、PA-18、PA-14、PA-42、PA-23、PA-31、PA-96、PA-54、PA-82、PA-85、PA-49、PA-43、PA-8為1個(gè)類群;PA-20、PA-41為1個(gè)類群;PA-51為1個(gè)類群;PA-46為1個(gè)類群;PA-186為1個(gè)類群。

圖1 引物SE18對(duì)菊苣擴(kuò)增的RAPD圖譜Fig.1 RAPD fingerprint of C.intybus with primer SE18

表1 引物、序列和擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Primers,sequences and amplified results

圖2 29份菊苣材料的RAPD聚類分析樹狀圖Fig.2 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei-Li’s genetic similarity coefficients

2.3 形態(tài)特征變化

黔引普那菊苣葉片為披針形,突變后形態(tài)特征發(fā)生變化,出現(xiàn)橢圓形、羽狀及披針形葉。并且有葉色變淺、葉色變深、葉片變薄、葉片變厚、葉脈出現(xiàn)紫紅色等現(xiàn)象,其部分特征特性見表2,差異顯著性檢驗(yàn)見表3。

表2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Table 2 Observation results of morphologic chatacteristic

續(xù)表2 Continued

表3 供試的29個(gè)菊苣品系生產(chǎn)性能Table 3 Production performance of 29 C.intybus provided in experiment

2.4 菊苣新品系牧草生產(chǎn)性能

參試29個(gè)菊苣品系在株高40cm時(shí)刈割,其年產(chǎn)草量結(jié)果見表3,經(jīng)方差分析,產(chǎn)量差異達(dá)極顯著水平(P<0.01),產(chǎn)量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA-31、PA-43、PA-42、PA-95、PA-11、PA-186、PA-49、PA-20、PA-93、PA-82、PA-54、PA-96。

采用離差平方和法對(duì)29個(gè)菊苣材料進(jìn)行聚類(圖3),PA-31、PA-43、PA-42、PA-95、PA-11、PA-186、PA-49、PA-20、PA-93、PA-82為第1類群,產(chǎn)量較高;PA-54、PA-57、PA-36、PA-96、PA-26、PA-8、PA-89、PA-45為第2類群,產(chǎn)量中等;PA-92、PA-14、PA-85、PA-52、PA-46、PA-41、PA-33、PA-51、PA-62、PA-23、PA-18為第3類群,產(chǎn)量較低。

圖3 29個(gè)菊苣品系產(chǎn)量聚類圖Fig.3 Production dendrogram for 29 C.intybus strains

3 討論與結(jié)論

從RAPD聚類結(jié)果和表型特征來看,相似性最高的2份材料PA-92和PA-26,兩者找不到明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系,從外型看,一個(gè)為羽狀葉,一個(gè)葉片為披針型,只有葉脈綠色這一共同點(diǎn)。相似性較低的PA-186和PA-18在葉型上基本一致,均為披針形,但葉脈顏色不同,一個(gè)為綠色,一個(gè)為紫色。而PA-43和PA-41相似性較低,從外型上看也明顯不一致,一個(gè)為披針形葉,一個(gè)為羽狀葉。但在第1類群中,從葉型上看,除PA-26以外,其余材料均為披針形葉,葉脈顏色以綠色為主。以前的研究表明RAPD方法得到的聚類圖可以反映品種的親本特征及育種歷史,但是聚類結(jié)果與表型特征相關(guān)性卻較差[18],對(duì)聚類結(jié)果與表型特征不完全一致這一現(xiàn)象,該研究有與之相類似的結(jié)論。

從菊苣牧草生產(chǎn)性能聚類結(jié)果看,產(chǎn)量高于目前主推品種黔引普那菊苣和將軍的品系有PA-31、PA-43、PA-42、PA-95、PA-11、PA-186、PA-49、PA-20、PA-93、PA-82、PA-57、PA-96共12個(gè),且葉型集中為披針形葉和橢圓形葉。有PA-49、PA-11、PA-42、PA-95、PA-82、PA-93、PA-20等7個(gè)品系既高產(chǎn)又抗旱[19],抗旱材料多數(shù)集中在RAPD聚類結(jié)果中的第2類群。對(duì)高產(chǎn)抗逆菊苣新品種選育具有非常重要的實(shí)際意義。

在生產(chǎn)利用中建植高產(chǎn)持久性人工草地時(shí)為了得到均一的形態(tài)外觀,要求所選用品種的形態(tài)特征盡可能一致,但是,同時(shí)為了提高其抵抗外界生物及非生物脅迫的能力,則品種之間要求有較高的遺傳多樣性。在檢測(cè)的29份菊苣材料中,形態(tài)特征較一致而相似性系數(shù)較低的材料,如PA-93、PA-82都是披針形葉,葉色深綠達(dá)9級(jí),有絨毛,葉脈綠色,且比較抗旱、高產(chǎn),所以適合一起混播建植人工草地。

菊苣作為一種引進(jìn)牧草品種,國內(nèi)資源稀有,雖有對(duì)不同品種及地域的種質(zhì)資源進(jìn)行分析研究的相關(guān)報(bào)道[11-16],但從總的來說,研究相對(duì)于其他牧草[20]還有差距,目前所獲得有關(guān)菊苣遺傳多樣性的信息相對(duì)很少,該內(nèi)容為菊苣研究提供了較為豐富的種質(zhì)資源,且這樣的信息對(duì)于構(gòu)建分子遺傳圖譜的作圖群體及明確種質(zhì)資源收集和利用目標(biāo)非常重要。所以,在今后的研究中,應(yīng)該通過分子標(biāo)記建立菊苣分子遺傳圖譜,并加強(qiáng)對(duì)該研究中選出的高產(chǎn)抗旱材料進(jìn)行深入研究,這將有助于檢測(cè)植物種內(nèi)的遺傳變異和分析基因組的結(jié)構(gòu)組成[21],定位和克隆重要的農(nóng)藝基因(如抗病、抗旱基因)[22],檢測(cè)和標(biāo)記數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTLs),并應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種以改良植物重要農(nóng)藝[23,24],及通過采用DNA標(biāo)記的原位雜交方法構(gòu)建特定染色體的物理圖譜[25],為其在生產(chǎn)中應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

航天誘變?cè)谲俎?、紅豆草、沙打旺等豆科牧草上有所應(yīng)用,并表現(xiàn)出較好的誘變效果[17]。本研究首次將航天誘變應(yīng)用于菊科植物菊苣,獲得了部分優(yōu)良突變材料且能夠穩(wěn)定遺傳,進(jìn)一步驗(yàn)證了航天誘變處理變異頻率高、良性變異多、穩(wěn)定快的特點(diǎn)。證明通過航天誘變誘導(dǎo)菊苣突變體是有效的,為進(jìn)一步利用航天誘變,建立突變體庫提供了依據(jù)。

[1]Rumball W.‘Grassland puna’chicory(CichoriuminterbusL.)[J].New Zealand Journal of Experimental Agricultrue,1985,14:165-171.

[2]Damato G.Cultural practices,yield and quality of seed in two cultivars of chicory(cichoriumintybus)[C].Proc 8th IS on Timing of Field Prod in Vegetables,2000:67-74.

[3]Hume D E,Lyons T B,Hay R J M.Evaluation of‘Grasslands Puna’chicory(CichoriumintybrsL.)in various grass mixtures under sheep grazing[J].New Zealand Journal of Agricultural Research,1995,38:317-328.

[4]Boyd D C,Rogers M E.Effect of Salinity on the growth of chicory(Cichoriumintybuscv.Puna)-apotential dairy forage species for irrigation areas[J].Australian Journal of Experimental Agriculture,2004,44:189-192.

[5]熊先勤,韓永芬,陳培燕,等.普那菊苣生長發(fā)育規(guī)律研究[J].草業(yè)科學(xué),2006,(7):23-27.

[6]韓永芬,李辰瓊,陳培燕,等.普那菊苣高產(chǎn)配套栽培技術(shù)研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(1):45-46.

[7]左相兵,韓永芬,陳培燕,等.普那菊苣飼喂新西蘭肉兔的效果研究[J].四川草原,2004,(7):14-15.

[8]左相兵,韓永芬,劉鳳霞,等.普那菊苣飼喂三元雜交豬的效果[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(2):65-66.

[9]劉鳳霞,韓永芬,舒健虹.施肥量、密度對(duì)“黔引普那菊苣”種子產(chǎn)量的影響[J].草業(yè)與畜牧,2009,(4):14-16.

[10]孫孌姿,王佺珍,呼天明,等.菊苣葉提取物對(duì)粘蟲的生物活性研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(4):60-66.

[11]Van Cutsem P,du Jardin P,Boutte C,etal.Distinction between cultivated and wild chicory gene pools using AFLP markers[J].Theoretical and Applied Genetics,2003,107:713-718.

[12]Baes P G,Van Cutsem P J.Chicory seed-lot variety identification by leucine-aminopeptidase and esterase zymogram analysis[J].E-1ectr_ophoresis,1992,13:885-886.

[13]Baes P G,Van Cutsem P J.Isozyme polymorphism in three gene pools of cultivated chicory(CichoriumintybusL.)[J].Euphytica,1993,71:143-150.

[14]Kiers A M,Mes T,van der Meijden R,etal.A search for diagnostic AFLP markers inCichoriumspecies with emphasis on endive and chicory cultivar groups[J].Genome,2000,43:470-476.

[15]Koch G,Jung C.Phylogenic relationship of industrial chicory varieties revealed by RAPDs and AFLPs[J].Agronomy,1997,17:323-333.

[16]羅燕,白史且,彭燕,等.菊苣種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(5):139-147.

[17]任衛(wèi)波,韓建國,張?zhí)N薇,等.航天育種研究進(jìn)展及其在草上的應(yīng)用[J].中國草地學(xué)報(bào),2006,(5):91-97.

[18]Roldan-ruiz I,van Eeuwijk F A,Gilliland T J,etal.A comparative study of molecular and morphological methods of describing relationships between perennial ryegrass(LoliumperennneL)varieties[J].Theoretical Applied Genetic,2001,103:1138-1150.

[19]韓永芬,盧欣石,王鐵梅,等.菊苣航天誘變新品系葉片旱生結(jié)構(gòu)的比較研究[J].中國草地學(xué)報(bào),2011,(1):111-115.

[20]李惠英,婁燕宏,胡濤,等.中國高羊茅種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(6):208-214.

[21]O’Donoughue L S,Souza E,Tanksley S D,etal.Relationships among North American oat cultivars based on restriction fragment length polymorphisms[J].Crop Science,1994,34:1251-1258.

[22]Martin G B,Brommonschenkel S H,Chunwongse J,etal.Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato[J].Science,1993,262:1432-1436.

[23]Westerbergh A,Doebley J.Quantitative trait loci controlling phenotypes related to the perennial versus annual habit in wild relatives of maize[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,109:1544-1553.

[24]Borner A,Korzun V,Voylokov A V,etal.Detection of quantitative trait on chromosome 5Rof rye(SecalecerealeL.)[J].Theoretical and Applied Genetics,1999,98:1087-1090.

[25]Wanous M K,Gustafson J P.A genetic map of rye chromosome 1Rintegrating RFLP and cytogenetic loci[J].Theoretical and Applied Genetics,1995,91:720-726.

猜你喜歡
菊苣草業(yè)類群
青海草業(yè)
薏苡種質(zhì)資源ISSR分子標(biāo)記篩選及親緣關(guān)系分析
黑石頂自然保護(hù)區(qū)土壤動(dòng)物功能類群對(duì)季節(jié)動(dòng)態(tài)的響應(yīng)
2017 年第1 期《草業(yè)科學(xué)》審稿專家
2015年3月草業(yè)科學(xué)大事記
2015年6月草業(yè)科學(xué)大事記
2011年春夏季黃海和東海微型浮游動(dòng)物類群組成及其攝食的研究
菊苣無公害栽培技術(shù)及利用
紅旗農(nóng)場菊苣高產(chǎn)栽培
龍灣自然保護(hù)區(qū)森林土壤動(dòng)物群落多樣性及功能類群