韓明鵬，王彥華，高永革，張曉霞，蘇芳蕊，許紅，王成章＊

（1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州450002；2.河南省飼草飼料站，河南 鄭州450008；3.河南農業(yè)大學信息與管理科學學院，河南 鄭州450002）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是在世界范圍內栽培歷史最悠久、面積最廣泛的豆科牧草，堪稱“牧草之王”［1］。紫花苜蓿具有產草量高、富含蛋白質、生物固氮能力強和適應性廣的特性，對我國畜牧業(yè)的發(fā)展、食品安全等具有重大作用。但隨著人類活動的增加，全球氣溫逐年上升，高溫熱害變得非常突出，嚴重抑制植物特別是紫花苜蓿的生長發(fā)育，影響到紫花苜蓿的產量和品質［2，3］。高溫能使紫花苜蓿植株生長緩慢、枯萎甚至死亡，病蟲害增多，產量和品質下降，是限制其推廣利用的重要環(huán)境因子之一。目前高溫對紫花苜蓿的研究方面主要集中在高溫對紫花苜蓿生產性能的影響、紫花苜蓿適應高溫脅迫的機制及其耐熱性評價指標的選擇和可靠性評價的方法等方面［4－7］，而針對在分子水平尋找紫花苜蓿耐熱基因的研究還未有報道。

耐熱性是目前抗性研究中的一個重要方面，但耐熱性是一個非常復雜的性狀，長期以來人們對紫花苜蓿耐熱性的了解主要來自于生理學的研究，如有機溶質的積累和熱誘導蛋白的產生等［8－10］。隨著分子生物技術的發(fā)展，人們對耐熱性的了解逐漸深入到分子水平。由于植物的高溫脅迫反應是一個多基因參與的系統(tǒng)調控過程，盡管傳統(tǒng)的研究方法已取得一些成果，但是要想從根本上闡明高溫脅迫機制尚有很大差距。這就需要在全基因組水平上對其進行整合性研究。隨著生物技術、基因組學和生物信息學的發(fā)展，目前已出現(xiàn)了一系列大規(guī)模分離差異表達基因的方法。

抑制性消減雜交技術（SSH）是由Diatchenko等［11］于1996年以mRNA差異顯示技術為基礎建立起來的篩選未知差異基因的新技術。采用該技術在較短時間內即可獲得差異表達基因的cDNA片段，可使低豐度的mRNA得以高于1 000倍以上的富集，從而使某些低豐度表達的mRNA有望被檢出［12］。近年來SSH技術在植物抗逆性研究上展現(xiàn)了良好的應用前景。劉春燕等［13］構建了大豆花葉病毒脅迫誘導的消減文庫并對其進行了初步分析，研究了花葉病毒脅迫下大豆基因的表達調控。夏卓盛等［14］以鋁離子脅迫的紫花苜蓿幼根為材料，構建了紫花苜蓿鋁脅迫的抑制消減文庫，研究了鋁脅迫下的基因差異表達。Jin等［15］以鹽脅迫的紫花苜蓿10日齡幼苗為材料，構建了紫花苜蓿鹽脅迫的抑制消減雜交文庫，對文庫及其部分耐鹽基因進行了分析。而SSH文庫在紫花苜?？篃嵝匝芯糠矫娴膱蟮篮苌?。

本研究以秋眠6級的紫花苜蓿ABI 700為材料，采用抑制性消減雜交技術構建了高溫脅迫下紫花苜蓿幼嫩莖葉的正向抑制消減cDNA文庫，旨在為紫花苜蓿耐熱機制研究和耐熱相關基因的克隆提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗以秋眠6級的紫花苜蓿（ABI 700）為材料，產地為美國，以45℃高溫處理過的幼嫩莖葉為處理組（tester），以同一植株正常條件（22℃）下生長的幼嫩莖葉為對照組（driver）。整個試驗于2010年5月－2010年10月在中國農業(yè)科學院棉花研究所（安陽）重點實驗室進行。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株 DH5α電轉化感受態(tài)細胞（E.coliElectro－Cell DH5α）、pMD 18－T Vector［（抗性標記為氨芐青霉素（Amp）］，購自 TaKaRa公司。

1.1.3 試劑和酶 總RNA提取試劑盒RNAiSo Plus、mRNA純化試劑盒OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit、DNA片段純化試劑盒 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、Taq DNA 聚合酶均購自TaKaRa公司；抑制消減雜交試劑盒PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit和聚合酶 Advantage cDNA Polymerase Mix購自Clontech公司；其他生化試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和mRNA的分離純化 紫花苜蓿幼嫩莖葉總RNA的提取采用寶生物公司（TaKaRa）的RNAiso Plus試劑，經紫外分光光度計測定后，置于－70℃冰箱保存。mRNA的分離純化使用寶生物公司（TaKaRa）的 mRNA純化試劑盒 OligotexTM－dT30＜Super＞mRNA Purification Kit，按照試劑盒說明書純化mRNA，并用紫外分光光度計檢測其濃度，立即進行下一步實驗。

1.2.2 抑制消減雜交（SSH） 具體實驗步驟按照 Clontech公司（美國）的 PCR－SelectTMcDNA Subtraction Kit的方法進行。以45℃高溫脅迫下的紫花苜蓿幼嫩莖葉為試驗方（tester），以正常條件下（22℃）生長的紫花苜蓿幼嫩莖葉為驅動方（driver），把從總RNA中分離純化的tester和driver組的mRNA分別逆轉錄成雙鏈cDNA，然后用四堿基序列的限制性內切酶Rsa I將其充分酶切。酶切產物用常規(guī)的酚、氯仿和異戊醇純化。將酶切過的tester cDNA平均分成2份，在T4DNA連接酶的作用下分別與接頭1和2R連接，16℃連接過夜，制成tester－1cDNA和tester－2RcDNA，并進行接頭連接效率的分析。對已經加上接頭1和2R的tester cDNA分別與過量的未加接頭的driver cDNA進行第1次消減雜交，雜交條件為98℃1.5min，68℃8h。之后，再加入新鮮變性的driver cDNA于第1次雜交的2組產物中，68℃雜交過夜，結束后加入200μL無菌水進行稀釋，混勻，68℃溫浴7 min。雜交稀釋后，根據(jù)接頭1和2R外側序列設計的PCR（聚合酶鏈式反應）引物1對消減雜交產物進行第1次PCR擴增；第1次PCR擴增產物用無菌水稀釋10倍，再用巢式PCR引物Nested primer 1和Nested primer 2R進行第2次PCR擴增。具體接頭和引物序列見產品使用說明書。

1.2.3 cDNA消減文庫的構建 第2次PCR產物經TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0純化后，取4μL與pMD 18－T Vector克隆載體連接，16℃連接過夜，經乙醇沉淀后，取2μL加入電轉化感受態(tài)細胞（E.coliElectro－Cell DH5α）中，混合液注入于冰水中預冷的0.1cm 電擊杯（Bio－Rad）中。1.5kV 電壓、200Ω電阻沖擊后，向電擊杯中迅速加入1mL預冷的LB培養(yǎng)基。將菌液置于離心管中37℃振蕩培養(yǎng)1h（180 r／min）。取100μL涂于含有氨芐青霉素的LB／X－gal／IPTG的固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜，放入4℃冰箱1h充分顯色。培養(yǎng)皿上可見藍白分明的菌落。剩余培養(yǎng)液加入甘油，液氮速凍后，－70℃保存。

1.2.4 PCR鑒定重組子 隨機挑取120個白色單菌落，接種于含1mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）的離心管中，37℃輕搖6～8h。直接取1μL菌液作為PCR模板，以Nested primer 1和Nested primer 2R作為引物，PCR擴增插入片段。10μL的反應體系：模板1μL、Nested primer 1（10μmol／L）0.8μL、Nested primer 2R（10 μmol／L）0.8μL、dNTP（2.5mmol／L each）0.8μL、10×PCR buffer 1μL、Taq酶0.3μL，補無菌水至總體積為10μL。反應程序：94℃10min；94℃30s，66℃30s，72℃90s，30個循環(huán)；72℃5min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。將單克隆菌液加入無菌甘油至終濃度15%，用液氮速凍后，置于－70℃冰箱長期保存。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取和mRNA的分離純化

總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其28S和18SRNA帶型清晰可見，且比例適當（圖1）。紫外分光光度計檢測其 OD260／280在1.9～2.0，表明總RNA質量好，純度高，滿足文庫構建的要求。總RNA經純化試劑盒純化后，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見其帶型呈彌散狀（圖1），紫外分光光度計檢測其OD260／280≈2.0，表明純化后的mRNA質量好，純度高，滿足文庫構建的要求。

2.2 cDNA合成以及cDNA酶切效果分析

mRNA反轉錄為雙鏈cDNA后用限制性四堿基內切酶Rsa I酶切，經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析反轉錄及酶切效果。結果表明（圖2），反轉錄后的雙鏈cDNA片段大部分集中在1 000～3 000bp，符合實驗的要求。酶切后的片段明顯較未經酶切片段減小，說明酶切比較完全，可以用于下一步實驗。

2.3 接頭連接效率檢測

dscDNA與接頭連接效率的高低是決定抑制性消減雜交成敗非常關鍵的一步。利用紫花苜蓿管家基因Actin的3′端（GCCGACCTCGTCATACTGGT）和5′端（TCTTTTGGATTGGGCTTCGT）特異引物（產物83bp）以及試劑盒所帶的3′端特異引物與PCR Primer 1（產物）對2組分別連接有 Adaptor 1（接頭1）和Adaptor 2R（接頭2R）的tester cDNA 進行PCR擴增，產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示（圖3），管家基因的3′端特異引物與接頭的外側引物Primer 1組合的擴增片段（連接接頭的PCR產物）大于管家基因3′端、5′端特異引物組合的擴增片段，與預期結果一致，灰度分析表明2組dscDNA接頭連接效率均在50%以上，接頭已經成功的連接。

圖1 紫花苜蓿幼嫩莖葉總RNA及mRNAFig.1 Total RNA and mRNA from tender stems and leaves of alfalfa

圖2 紫花苜蓿反轉錄cDNA Rsa I未酶切與酶切Fig.2 Reverse transcription cDNA of alfalfa after Rsa I digestion and not Rsa I digestion

2.3 消減雜交效率的檢測

以蒺藜狀苜蓿的管家基因α－tubulin為依據(jù)，設計引物進行消減雜交效率的檢測。引物序列為：3′（CACATTGCAAGCCGGTATGT）和 5′（ACCGGTCTCACTGAAGAASG）。同時，以未經抑制性消減雜交的cDNA T l－c（在制備tester cDNA 連接2種接頭時，將剛加好樣還沒有進行連接反應的連接有Adaptor 1和Adaptor 2R的tester cDNA 各取2μL混合，然后進行連接反應即可）作為對照進行PCR。PCR反應條件為：94℃預變性2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min擴增，并分別在第18，23，28和33循環(huán)處各取5 μL進行電泳，檢測消減雜交效率。結果如圖4所示，未消減產物中看家基因147bp片段在第28循環(huán)時出現(xiàn)，而消減產物中看家基因147bp片段未出現(xiàn)。由此可見，消減產物中看家基因表達豐度已大大下降，消減雜交已有效完成。

2.4 消減PCR結果

第1次和第2次PCR擴增結束后，分別取tester消減、tester未消減、對照RNA消減、對照RNA未消減、PCR陽性對照產物6μL并排進行電泳檢測。消減雜交第1次PCR結果（圖5）顯示，第1次PCR擴增的電泳帶較弱，經抑制消減雜交后擴增出的cDNA片段大小介于250～1 000bp，而未經抑制消減雜交處理擴增出的cDNA片段大小介于100～2 000bp，并且經過消減雜交后擴增出的PCR產物亮度明顯弱于未經過消減雜交的PCR產物，這也說明消減雜交有效的完成。消減雜交第2次PCR結果（圖6）顯示，經過2輪消減雜交和2輪PCR后，消減雜交后擴增出的PCR產物亮度和未經過消減雜交的PCR產物相當，tester中的差異表達基因得到有效地富集和擴增，這也說明消減雜交是成功的。

2.5 消減文庫中插入片段的PCR鑒定

經過2次選擇性PCR富集的消減產物第2次PCR產物純化后與pMD－18T進行連接，轉化到DH5α電轉化感受態(tài)細胞（E.coliElectro－Cell）中培養(yǎng)擴增，得到消減文庫。對陽性克隆進行菌液PCR鑒定插入片段，引物采用第2次PCR時的巢式引物1和2R。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖7）顯示，文庫克隆的重組率為99%，片段大小集中分布于250～750bp。

2.6 cDNA文庫的滴度和重組率測定

從cDNA文庫中取50μL，涂于含IPTG和X－gal的平板上，培養(yǎng)過夜后，計算菌斑個數(shù)，按下式計算cDNA文庫的滴度。分別計數(shù)藍斑和白斑的個數(shù)，計算重組率。結果表明，文庫滴度為4 230pfu／mL；重組率為97.8%。

2.7 BlastX分析及功能的預測

隨機挑取120個白色菌落進行PCR鑒定，其中的陽性克隆送至北京華大基因公司進行測序。將測得的序列去除引物、接頭和載體序列，提交到NCBI（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進行序列比對，部分比對結果如表1。

圖3 接頭連接效率檢測Fig.3 Detection of ligation efficiency of adapor

圖4 消減雜交效率檢測Fig.4 PCR analysis of subtraction efficiency

3 討論

Diatchenko等［11］于1996年建立了一種應用PCR方法的抑制消減雜交技術。抑制消減雜交技術利用了消減雜交技術、限制性內切酶與抑制性PCR相結合的方法，經過2次雜交和2次PCR，以富集和獲得目標片段，具有以下優(yōu)點：1）假陽性率被大大降低，可獲得較多的特異性表達產物，陽性率達94%［16］；2）具有高敏感性，均等化富集目標片段，避免了表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）分析中高豐度基因重復測序的缺點，使得低豐度mRNA也能被檢測到［17］。因此SSH技術被廣泛應用于植物差異表達基因的分離［18－21］。

圖5 消減產物第1次PCRFig.5 The first PCR products of subtracted

圖6 消減產物第2次PCRFig.6 The second PCR products of subtracted

圖7 PCR檢測消減cDNA文庫克隆插入片段Fig.7 Identification of the inserted cDNA fragments in subtractive cDNA library by PCR

表1 SSH cDNA文庫的BlastX分析及其功能蛋白的預測Table 1 BlastX analysis of SSH cDNA library and the prediction of functional proteins

本研究首次建立了紫花苜蓿高溫脅迫下差異表達基因的抑制消減cDNA文庫，對SSH文庫的各個關鍵步驟如：總RNA及mRNA質量、Ras I的酶切效果、接頭的連接效率、消減效率和轉化效率等的檢測顯示，消減文庫有較高的質量。構建一個好的差異表達cDNA文庫對起始mRNA的完整性和純度要求非常高。本試驗的結果表明，試驗獲得的總RNA含量高，完整性好，紫外分光光度計檢測其OD260／280在1.9～2.0。mRNA的完整度和純度也達到了文庫構建的要求，紫外分光光度計檢測其OD260／280≈2.0。本試驗抑制消減雜交試驗中，從反轉錄合成cDNA及Ras I酶切的檢測、加接頭后的接頭連接效率到消減cDNA片段的消減效率分析，都隨時監(jiān)控著各個試驗環(huán)節(jié)，保證最終獲得高質量的差異表達cDNA文庫。利用T／A克隆技術，將特異性擴增的PCR產物直接與T載體進行連接，文庫的構建采用DH－5α電轉化感受態(tài)細胞，大大提高了文庫的轉化效率。擴增文庫后，經過初步藍白班篩選120個陽性克隆，菌落PCR擴增電泳圖譜檢測，文庫滴度為4 230pfu／mL，文庫克隆的重組率為97.8%，片段長度集中分布于250～750bp。這些結果直接說明獲得了高質量的正向差異表達cDNA文庫。

綜上所述，利用SSH技術構建紫花苜蓿高溫脅迫差異表達基因文庫，通過EST技術研究抗熱過程差異表達的抗熱相關基因的表達情況，從總體上闡述紫花苜?？篃釞C制已成為可行的研究方法?？篃峄虻难芯坎粌H僅是抗熱過程的識別和抗熱基因的開啟，更是注重抗熱過程中系列基因的表達以及抗病信號的傳遞和級聯(lián)反應，這將更加有助于對抗熱機制的深入研究。

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