劉登群，龍 爽，王軍平，史春夢，冉新澤，粟永萍

第三軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院防原醫(yī)學教研室全軍復合傷研究所創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶400038

正常的胃腸道運動功能是機體消化吸收營養(yǎng)物質、傳遞神經信號及抵抗外源致病菌入侵的重要生理基礎。胃腸道運動功能的產生和維持是胃腸道神經元、平滑肌細胞以及Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)三者協(xié)同作用的結果［1-2］。由于 ICC 能夠自發(fā)產生電慢波，且能夠介導神經遞質從神經元向平滑肌的傳導過程，因此探討ICC的生物學行為對進一步闡明胃腸運動機制、治療胃腸運動功能障礙具有重要意義。目前對ICC的研究多限于動物在體模型，也曾文獻報道過ICC的體外分離培養(yǎng)，但其通常使用幼年動物，分離效率、細胞純度均有較大差異。本文在綜合分析以往報道的基礎上，提出可以聯(lián)合使用酶消化-組織塊培養(yǎng)方法培養(yǎng)成年C57BL/6小鼠的空腸ICC。該方法能夠較方便地實現(xiàn)ICC的體外培養(yǎng)，為進一步研究其在胃腸運動中的作用及機制提供了一定的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 正常6～8周齡的C57BL/6小鼠購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。DMEM/F12培養(yǎng)基購自 Hyclone公司，重組小鼠干細胞因子(mSCF)、Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司，胎牛血清購自Gibco公司，大鼠抗小鼠c-Kit抗體購自eBioscience公司，小鼠抗平滑肌激動蛋白(SMA)購自Santa Cruz，封閉用正常山羊血清購自北京中山公司，100×青霉素-鏈霉素溶液、Cy3標記山羊抗大鼠二抗、FITC標記羊抗小鼠二抗、Fluo-3 AM鈣離子熒光探針購自碧云天公司。

1.2 肌條分離與消化 小鼠禁食24 h后開始實驗。頸椎脫臼法處死小鼠，使用酒精對腹部進行消毒后，超凈臺上打開腹腔，截取空腸中段約5 cm的小腸，仔細剝去腸系膜和血管，在已加入雙抗的4℃ D-Hanks液中縱行剖開小腸，將內容物漂洗干凈，轉入干凈的上述D-Hanks液中。解剖顯微鏡下仔細剝去小腸黏膜層和黏膜下層，僅留取肌層。撕取一定數(shù)量肌層組織后，將肌條剪碎至2 mm3左右小塊后放入含有Ⅱ型膠原酶(1.3 mg/mL)的EP管內，置于37℃消化20 min，期間振蕩混勻數(shù)次，隨后1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基進行重懸。

1.3 組織塊懸液的培養(yǎng) 將DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含90%DMEM/F12，10%FBS，10 ng/mL SCF，1%的100×青霉素-鏈霉素)重懸后的組織懸液加入到6孔板中，板中預先放入鼠尾膠原包被的小蓋玻片。將6孔板放入37℃培養(yǎng)箱內，5%CO2條件下培養(yǎng)。接種72 h后進行首次換液，小心洗去組織塊，加入足量完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此后每3 d換液一次，觀察細胞生長情況。

1.4 培養(yǎng)細胞的鑒定

1.4.1 小腸肌層分離效果確認:使用4%多聚甲醛將細胞固定培養(yǎng)前分離得到的小腸平滑肌肌條和完整的小腸，常規(guī)脫水并石蠟包埋，切片進行HE染色，以確認分離所得組織是否為小腸環(huán)形肌和縱行肌。

1.4.2 培養(yǎng)細胞的形態(tài)學觀察:倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)不同時間的組織塊和細胞形態(tài)，使用Olympus BX51數(shù)碼相機拍照。

1.4.3 免疫熒光染色:細胞培養(yǎng)7 d后，使用Histochoice MB對細胞進行固定，固定后半小時取出細胞爬片進行免疫熒光檢測。染色主要步驟:使用0.01 mol/L的PBS充分漂洗玻片，滴加含有0.1%Triton X-100的0.01 mol/L PBS進行透膜處理，室溫條件下作用20 min。PBS漂洗后滴加封閉用正常山羊血清，室溫下封閉30 min。加入1∶100稀釋的c-Kit單克隆抗體，置于4℃過夜，次日PBS漂洗玻片后加入1∶250稀釋的Cy3標記羊抗大鼠二抗，室溫條件下避光孵育1 h，PBS漂洗后繼續(xù)加入1∶100稀釋的小鼠抗平滑肌激動蛋白(SMA)一抗，4℃過夜孵育后漂洗玻片并加入1∶100稀釋的FITC標記羊抗小鼠二抗，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗后DAPI復染胞核。抗熒光淬滅水溶性封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察染色效果并照像。

1.4.4 培養(yǎng)細胞的鈣離子流檢測:配置終濃度為5 μmol/L的Fluo-3 AM完全培養(yǎng)基，使用該培養(yǎng)基對細胞進行換液，于37℃孵育50 min進行熒光探針裝載，隨后更換為普通完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃孵育20 min，以確保Fluo-3 AM在細胞內完全轉變?yōu)镕luo-3。使用激光共聚焦顯微鏡進行照相并分析細胞內鈣，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525～530 nm。

2 結果

2.1 石蠟切片證實分離的組織為空腸肌層 解剖顯微鏡下分離所得組織石蠟包埋后切片，進行HE染色，可見該組織僅含有空腸的平滑肌，包括縱行肌和環(huán)形肌，不含黏膜層和黏膜下層(見圖1)。該組織培養(yǎng)所得ICC主要屬于ICC-MY亞型。

2.2 培養(yǎng)所得細胞具備ICC的形態(tài)特點 培養(yǎng)24 h后可見有少量細胞貼壁(見圖2A)，繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，可見大量細胞從平滑肌組織中爬出并貼壁生長(見圖2B)。培養(yǎng)5～7 d后，可見培養(yǎng)所得細胞呈梭形，且有2～3個細長突起，同時細胞之間彼此相互連接，類似在體的ICC細胞網絡(見圖2C、2D)。

2.3 免疫熒光染色鑒定細胞表型 c-Kit陽性是目前確認細胞是否為ICC的重要指標。使用免疫熒光雙標對培養(yǎng)至2周的細胞進行表型分析，可見該細胞呈c-Kit陽性(見圖3A)，而平滑肌細胞標志物平滑肌肌動蛋白(SMA)呈陰性(見圖3B)，DAPI復染細胞核后可見c-Kit陽性細胞均為SMA陰性(見圖3C、3D)。此外結合該細胞的形態(tài)學特點，可以排除肥大細胞污染。因此免疫表型分析可證實培養(yǎng)所得細胞為ICC，而不是平滑肌細胞。

2.4 Fluo-3 AM染色證實該細胞具有鈣離子波動 使用Fluo-3 AM染色后，在共聚焦顯微鏡下，可以看到ICC的胞漿中含有一定的鈣離子(見圖4A)。在不改變培養(yǎng)基中鈣離子濃度的條件下，細胞胞漿中的鈣離子濃度能夠周期性的自發(fā)增加(見圖4B)，提示該培養(yǎng)的ICC細胞能夠自發(fā)產生鈣離子振蕩，具備形成慢波的功能。

3 討論

圖1 HE染色確認分離組織的結構特點 A:分離所得組織的HE染色，可見僅含小腸肌層組織;B:撕片前完整小腸的HE染色(Bar=100 μm);圖2 不同培養(yǎng)時間ICC細胞形態(tài) A:培養(yǎng)24 h可見少量細胞貼壁;B:培養(yǎng)72 h可見大量細胞圍繞組織塊生長;C、D:培養(yǎng)至5～7 d的ICC細胞呈梭形，胞體有2～3個細胞突起，且彼此之間交織成細胞網絡;圖3 培養(yǎng)細胞的免疫熒光染色 A:Cy3標記二抗顯示該細胞呈c-Kit陽性;B:FITC標記二抗顯示該細胞呈SMA陰性;C:DAPI染色顯示細胞核位置;D:疊加圖像證實培養(yǎng)的細胞表達c-Kit而不表達SMA(Bar=100 μm);圖4 培養(yǎng)的ICC自發(fā)產生鈣離子振蕩 A:細胞處于基礎狀態(tài)時的Fluo-3染色;B:細胞胞漿鈣離子釋放時的Fluo-3染色(Bar=25 μm)Fig 1 HE staining identified the structural characteristics of isolated tissues A:HE staining of isolated tissue showed that it only contained the muscle layer of small intestine;B:HE staining of whole small intestine before whole mount preparation(Bar=100 μm);Fig 2 Morphology of cultured ICC at different phase points A:several attached cells could be found at 24 h;B:Many cells attached around the tissue at 72 h;C，D:ICC cultured for 5～7 days appeared to be spindle shaped，contained 2～3 processes，and formed network structure;Fig 3 Immunofluorescence staining of cultured ICC A:Cy3 signals indicated c-Kit positive cells;B:No FITC signals indicated these cells were SMA negative;C:DAPI showed cell nucleus;D:Merged image showed cultured cells expessed c-Kit but not SMA(Bar=100 μm);Fig 4 Cultured ICC generated spontaneous calcium oscillation A:Basic Fluo-3 staining of ICC;B:Spontaneously increased Fluo-3 signals in cytoplasm of cultured ICC(Bar=25 μm)

1893 年西班牙神經解剖學家Cajal通過甲基蘭和鍍銀染色在豚鼠和家兔小腸發(fā)現(xiàn)了Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)，隨后學者們相繼證實ICC在正常胃腸運動產生和維持及胃腸動力障礙性疾病的發(fā)生過程中重具有重要作用。大量的研究表明ICC具有產生電慢波功能，能夠起搏胃腸運動，介導胃腸神經元和平滑肌細胞之間的信號傳導。以往對ICC的研究大多使用動物在體模型，然而由于在體實驗影響因素較多，因而學者們嘗試對ICC進行體外培養(yǎng)，以進一步研究其生物學特性。截止目前，國內外培養(yǎng)ICC 的方法主要包括消化培養(yǎng)［3，6］和組織塊培養(yǎng)［7］，這兩種培養(yǎng)方法各有利弊。不同發(fā)育階段中的ICC細胞網絡和增殖能力不同，與幼年動物的ICC相比，成年動物的ICC在正常條件下增殖能力較低，但損傷后可出現(xiàn)增殖［8-9］。為了使分離所得細胞更接近實際需要，我們嘗試聯(lián)合使用酶消化和組織塊培養(yǎng)這兩種方法來培養(yǎng)成年小鼠的空腸ICC。

根據解剖位置的不同，胃腸道的ICC被分作四種亞型，分別為黏膜下ICC(submucosal ICC，ICC-SM)、肌內ICC(intramuscular ICC，ICC-IM)、肌間叢ICC(myenteric ICC，ICC-MY)和深肌叢ICC(deep muscular plexus ICC，ICC-DMP)。在小鼠空腸中，ICC-MY是發(fā)揮起搏功能的主要細胞類型。因此我們在分離小腸肌條的過程中，通過HE染色確認分離所得肌條為空腸的環(huán)形肌和縱行肌，而不含有黏膜層和固有層，減少了其他雜細胞的污染。

以往有關ICC分離培養(yǎng)的方法中均使用到了Ⅱ型膠原酶，使用該膠原酶能夠較方便地消化肌條組織，進而獲得較多的單細胞。然而這種方法在獲取單細胞的同時，會造成ICC細胞表面相應受體(特別是c-Kit受體)的破壞，降低細胞活力［5］。因而在本實驗中，我們嘗試將膠原酶的消化時間縮短至20 min，這樣既對肌條進行了適度消化以便ICC從肌條中脫離，同時保證不過度損傷ICC活性。吳志軒等曾報道使用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)幼鼠空腸ICC［7］，此方法的優(yōu)勢在于能夠最大程度保持ICC細胞的組織微環(huán)境特點，提供維持ICC生長和表型的多種信號刺激。我們發(fā)現(xiàn)使用組織塊法培養(yǎng)成年小鼠的小腸平滑肌時，通常需要1周左右時間才有細胞從肌條中爬出并貼壁生長，且細胞數(shù)量較少。而使用膠原酶消化后的肌條進行培養(yǎng)，3 d左右即有大量細胞貼壁生長，因此聯(lián)合使用酶消化和組織塊培養(yǎng)能夠更方便獲得ICC，該細胞呈梭形，具有2～3個細胞突起，彼此之間相互交織成網絡狀。

酪氨酸激酶受體c-Kit是ICC重要的標志分子和功能分子，c-Kit/SCF信號刺激對于維持ICC的表型至關重要，因此在培養(yǎng)ICC時需要加入適量的SCF?？紤]到培養(yǎng)過程中SCF的消耗和降解，本實驗中我們增加了培養(yǎng)基中SCF的濃度，結果表明培養(yǎng)至14 d左右的ICC仍能保持c-Kit陽性。肌層中另一類c-Kit陽性的細胞是肥大細胞，但其通常呈圓形，可以從形態(tài)上與ICC相區(qū)分。研究表明周期性的鈣離子振蕩(calcium oscillation)是ICC產生電慢波的基礎［10］。我們使用Fluo-3 AM對培養(yǎng)的ICC進行染色，共聚焦顯微鏡觀察該細胞胞漿中的鈣離子濃度能夠自發(fā)地周期性波動，提示培養(yǎng)所得細胞具備產生電慢波的能力。在使用該方法培養(yǎng)ICC時，培養(yǎng)所得細胞中有時會混有一定量的平滑肌細胞，可以通過適當縮短首次換液時間減少平滑肌細胞的數(shù)量。

綜上所述，本文證實聯(lián)合使用膠原酶消化和組織塊培養(yǎng)能夠較方便地培養(yǎng)出成年小鼠的空腸ICC。該方法的建立為進一步研究成年小鼠空腸ICC的生物學行為和機制提供相對單一的細胞模型，該模型亦可用于多種胃腸運動障礙疾病中ICC功能異常機制的研究。

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