李潤(rùn)花,高晉華,裴彥江,李起超,申金雁,殷國(guó)榮

旋毛蟲病(trichinosis)是由旋毛形線蟲(Trichnella spiralis,簡(jiǎn)稱旋毛蟲)引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。近年來(lái),隨著燒、烤、涮等飲食方式的流行,旋毛蟲病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。旋毛蟲成蟲和幼蟲分別寄生于同一宿主的小腸和肌肉內(nèi),成囊期幼蟲(肌肉期幼蟲)可在宿主體內(nèi)存活數(shù)年,為主要致病蟲期。多種抗腸道線蟲藥對(duì)腸道旋毛蟲成蟲有很強(qiáng)殺死作用,但殺死橫紋肌內(nèi)成囊期幼蟲的效果較差,因而篩選抗成囊期幼蟲的有效藥物對(duì)于治療本病至關(guān)重要。

三苯雙脒(Tribendimidine,TBD)是中國(guó)食品與藥品管理局2004年首次注冊(cè)的抗腸道蠕蟲藥[2]。實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)證明,TBD對(duì)人蛔蟲、鉤蟲和蟯蟲感染的療效較好,驅(qū)蟲作用迅速,不良反應(yīng)輕微,無(wú)致突變性和致畸性[2-3],尤其對(duì)美洲鉤蟲感染的療效優(yōu)于阿苯達(dá)唑[4-6]。

有關(guān)TBD抗旋毛蟲的研究較少,尚無(wú)臨床應(yīng)用資料。張鴻滿等研究表明,TBD對(duì)大鼠腸道旋毛蟲成蟲有較強(qiáng)的驅(qū)殺作用,但對(duì)移行期和成囊期幼蟲的殺蟲作用不及阿苯達(dá)唑[7]。薛劍等實(shí)驗(yàn)表明TBD對(duì)小鼠旋毛蟲成蟲和移行期幼蟲有較好的療效,但對(duì)成囊期幼蟲無(wú)效[8]。本課題組前期研究表明,口服大劑量TBD可有效殺死小鼠橫紋肌中的成囊期幼蟲[9]。本研究比較了以不同療程口服大劑量TBD殺死小鼠肌肉中旋毛蟲成囊期幼蟲的效果,探討治療旋毛蟲病囊包期可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 三苯雙脒及配制 三苯雙脒(Tribendimidine,TBD)購(gòu)自山東新華制藥股份有限公司,批號(hào)0908036。用7%吐溫-80和 3%乙醇溶液配制30mg/ml的混懸液[7],用于灌胃給藥。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及蟲株 8周齡BALB/c小鼠80只(SPF級(jí)),體重20～24g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。旋毛形線蟲(T.spiralis,T1),引自首都醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室,山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)研究所接種小鼠保種。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物感染與治療 8周齡BALB/c小鼠40只,隨機(jī)均分為5組,每只小鼠口飼感染旋毛蟲成囊期幼蟲50條。感染后第29d,分別以不同療程(連續(xù)給藥2、4、6、8 d)口服三苯雙脒300mg/(kg·d),對(duì)照組不治療。記錄小鼠健康狀況。停藥后第7d,頸椎脫臼處死小鼠。肌肉壓片法觀察膈肌、咬肌、胸肌、腓腸肌中成囊期幼蟲存活情況并計(jì)數(shù)。

1.2.2 療效觀察 停藥后第7 d,頸椎脫臼處死小鼠。分別取每只小鼠膈肌、咬肌、胸肌、腓腸肌約0.1g,準(zhǔn)確稱重后,肌肉壓片法檢查成囊期幼蟲。光學(xué)顯微鏡觀察(×100),計(jì)算每克肌肉中成囊期幼蟲數(shù)、存活蟲數(shù)、死亡蟲數(shù)、計(jì)算減蟲率和死蟲率。每克肌肉幼蟲數(shù)=鏡檢蟲數(shù)÷肌肉重量(克);減蟲率=[(對(duì)照組平均蟲數(shù)-治療組平均蟲數(shù))÷對(duì)照組平均蟲數(shù)]×100%;死蟲率=死亡蟲數(shù)÷總蟲數(shù)×100%。為驗(yàn)證療效,另取40只8周齡BALB/c小鼠,隨機(jī)均分為5組,分別用不同療程治療后的小鼠膈肌成囊期幼蟲50條/只口飼感染,感染后第29d,肌肉壓片法計(jì)數(shù)膈肌中成囊期幼蟲。

1.2.3 成囊期幼蟲存活狀況的判斷 光學(xué)顯微鏡觀察(×100)每個(gè)成囊期幼蟲的存活狀況,并分別計(jì)數(shù)。參照文獻(xiàn)[9]中判斷存活和死亡成囊期幼蟲的標(biāo)準(zhǔn),將死亡成囊期幼蟲分為8類,即①囊包完整,幼蟲無(wú)規(guī)則卷曲;②囊包完整,幼蟲強(qiáng)直性伸展;③囊包完整,幼蟲結(jié)構(gòu)模糊;④囊包不完整,幼蟲結(jié)構(gòu)模糊;⑤囊包不完整,幼蟲部分崩解;⑥囊包不完整,幼蟲全部崩解;⑦囊包和(或)幼蟲鈣化;⑧囊包結(jié)構(gòu)模糊,幼蟲完全消失。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用(±s)表示,使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。多個(gè)樣本均數(shù)比較用方差分析及LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠健康狀況 實(shí)驗(yàn)期間,各組小鼠采食、飲水正常,健康狀況良好,未見藥物不良反應(yīng)。

2.2 成囊期幼蟲的蟲荷及減蟲率、死蟲率 以每克肌肉檢出幼蟲數(shù)為觀察指標(biāo),膈肌中成囊期幼蟲總數(shù)最高,咬肌次之,胸肌和腓腸肌相近。隨著TBD治療次數(shù)(療程)的增加,4個(gè)部位肌肉中成囊期幼蟲總蟲荷和活蟲數(shù)均呈下降趨勢(shì),而死蟲數(shù)呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,2 d療程組及2 d以上療程組膈肌、咬肌和腓腸肌中成囊期幼蟲總蟲數(shù)和存活蟲數(shù)均顯著減少(P＜0.05、P＜0.01),而胸肌中總蟲數(shù)僅在6 d療程組和 8 d療程組顯著減少(P＜0.05、P＜0.01)。隨著治療次數(shù)(療程)的增加,膈肌、咬肌、胸肌和腓腸肌的幼蟲死亡率呈上升趨勢(shì),其中6 d療程組分別為 96.16%、98.06、99.13%和98.56%(P＜0.01),8 d療程組組膈肌為99.62%、其他3部位肌肉均為100%(P＜0.01)。見表1-表4。

表1 口服三苯雙脒不同療程抗小鼠膈肌旋毛蟲成囊期幼蟲的效果Table 1 Effect of tribendimidine oral administration on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in diaphragmatic muscle in mice at different courses of treatment

表2 口服三苯雙脒不同療程抗小鼠咬肌旋毛蟲成囊期幼蟲的效果Table 2 Effect of tribendimidine oral administration on Trichinella spiralis encapsulated larvae in jugomaxillary muscle in mice at different courses of treatment

表3 口服三苯雙脒不同療程抗小鼠胸肌旋毛蟲成囊期幼蟲的效果Table 3 Effect of tribendimidine oral administration t on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in pectoral muscle in mice at different courses of treatmen

2.3 存活和死亡成囊期幼蟲的特征 依據(jù)本研究判斷存活和死亡成囊期幼蟲的標(biāo)準(zhǔn),將鏡下所見成囊期幼蟲逐個(gè)分類。現(xiàn)以膈肌為例,描述存活和死亡幼蟲的形態(tài)特征。圖1顯示了存活和死亡成囊期幼蟲的表現(xiàn),對(duì)照組膈肌成囊期幼蟲的密度最高,存活成囊期幼蟲的結(jié)構(gòu)清晰,囊包完整,幼蟲自然卷曲,幼蟲與囊包之間有明顯的較透明區(qū)。隨著療程增加,膈肌成囊期幼蟲的密度第次降低,存活幼蟲減少,死亡幼蟲增多。

2.4 療效驗(yàn)證性感染結(jié)果 以不同療程口服三苯雙脒治療后的小鼠膈肌成囊期幼蟲感染小鼠的療效驗(yàn)證性感染表明,對(duì)照組和2 d療程組小鼠的感染率均為100%,但2 d療程組的平均蟲荷顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。4 d及以上療程組小鼠的感染率降低,其中6 d(37.5%)和8 d(12.5%)與對(duì)照組差異顯著(P＜0.01)。2 d及以上療程組小鼠平均蟲荷和平均減蟲率均顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),見表5。

表4 口服三苯雙脒不同療程抗小鼠腓腸肌旋毛蟲成囊期幼蟲的效果Table 4 Effect of tribendimidine oraladministration at different courses of treatment on encapsulated larvae of Trichinella spiralis in gastrocnemius muscle in mice

圖1 口服三苯雙脒不同療程對(duì)小鼠膈肌中旋毛蟲囊包幼蟲的殺滅效果A.對(duì)照組(control group),B.2 d療程(2 d course of treatment),C.4 d療程(4 d course of treatment),D.6 d療程(6 d course of treatment)L.存活囊包幼蟲;1～8.死亡囊包幼蟲。1.囊包完整,幼蟲無(wú)規(guī)則卷曲;2.囊包完整,幼蟲強(qiáng)直性伸展;3.囊包完整,幼蟲結(jié)構(gòu)模糊;4.囊包不完整,幼蟲結(jié)構(gòu)模糊;5.囊包不完整,幼蟲部分崩解;6.囊包不完整,幼蟲全部崩解;7.囊包和(或)幼蟲呈黑色、鈣化;8.囊包結(jié)構(gòu)模糊,幼蟲完全消失。Fig.1 Effect of tribendimidine given orally at different courses of treatment against Trichinellaspiralis encapsulated larvae in diaphragmatic muscle in miceL.Survival encapsulated larva;1-8.Dead encapsulated larvae.1.Capsule is complete,larva is random coil;2.Capsule is complete,larva is tonic extension;3.Capsule is complete,structure of larva is cloudiness;4.Capsule is incomplete,structure of larva is cloudiness;5.Capsule is incomplete,larva is partial disintegration;6.Capsule is incomplete,larva is whole disintegration;7.Capsule and/or larva changed black and was calcification;8.Structure of capsule is cloudiness,larva is whole disappearance.

表5 以三苯雙脒治療后小鼠的膈肌再次感染小鼠的膈肌成囊期幼蟲數(shù)Table 5 Numbers of encapsulated larvae in diaphragmatic muscle in mice mice post-treatment with tribendimidine

3 討 論

本研究觀察了不同療程口服TBD 300mg/(kg·d)治療小鼠旋毛蟲成囊期幼蟲感染的效果,旨在確定一個(gè)合理療程。結(jié)果表明,隨著治療次數(shù)的增加,膈肌、咬肌、胸肌和腓腸肌中成囊期幼蟲總蟲數(shù)和存活蟲數(shù)呈趨勢(shì),而幼蟲死亡率呈上升趨勢(shì),以6d和8 d療程最為顯著,表明TBD的抗成囊期幼蟲效果具有療程依賴性。任海南等研究表明,三苯雙脒一次口服對(duì)小鼠的急性 LD50為 950±207mg/kg[10]。本研究所用TBD劑量為300mg/(kg·d),連續(xù)給藥8 d未見不良反應(yīng)。

許世鍔等給十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲感染者頓服TBD 400mg,觀察到對(duì)鉤蟲的體壁、腸管、睪丸及卵巢的超微結(jié)構(gòu)均有明顯的破壞作用,對(duì)卵巢的破壞最為嚴(yán)重[11]。Keiser等給感染麝貓后睪吸蟲地鼠單劑口服TBD 400 mg/kg可使蟲荷減少63.0%,掃描電鏡術(shù)觀察到TBD 10μ g/ml體外作用可致麝貓后睪吸蟲(Opisthorchisviverrini)皮層損傷[12]。

我們前期研究將判斷存活和死亡成囊期幼蟲的標(biāo)準(zhǔn)為6類[9]。本研究進(jìn)一步將死亡成囊期幼蟲的分類細(xì)化分為8類,更加合理。結(jié)果表明被TBD殺死成囊期幼蟲主要表現(xiàn)為蟲體部分或完全崩解,并可見空囊包和有愈合、消失的傾向的空囊包。據(jù)此推斷,成囊期幼蟲的總蟲荷降低的主要原因可能與幼蟲完全崩解后的空囊包愈合、消失有關(guān)。

有關(guān)研究證實(shí),TBD在胃腸道環(huán)境不穩(wěn)定,迅速分解成對(duì)-(1-二甲氨基乙亞氨基)苯胺(簡(jiǎn)稱氨脒,dADT)和對(duì)苯二甲醛,繼而代謝生成的乙酰氨脒(AdADT)、對(duì)苯二甲酸等產(chǎn)物吸收、分布迅速。大部分藥物在48h內(nèi)以dADT和AdADT的形式尿液排泄[13-14]。Xiao等研究證實(shí),TBD及其在體外有很強(qiáng)殺華支睪吸蟲成蟲作用,但AdADT的體外殺蟲作用很弱?？诜BD、dADT和AdADT對(duì)大鼠感染華支睪吸蟲有相似的療效,大鼠肌肉中TBD和dADT也表現(xiàn)抗華支睪吸蟲作用[15]。本研究觀察到TBD有效殺死不同部位肌肉中旋毛蟲成囊期幼蟲,說明TBD的代謝產(chǎn)物dADT和AdADT可隨血液循環(huán)到達(dá)全身肌肉。

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