李興玉,王 強,楊曉梅,牛李麗,謝 晶,余建秋,廖黨金,余星明,林 毅,鄧家波

禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起禽類(家禽和野禽)的一種危害嚴(yán)重的傳染病。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)可引起禽類大批發(fā)病死亡,也可引起人類感染死亡,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病,我國也將高致病禽流感列為一類重大動物疫病。目前流行于中國大陸的禽流感病毒主要血清型是H5亞型和H9亞型,H5亞型禽流感病毒是主要的高致病性毒株,可引起禽類大批急性發(fā)病死亡;H9亞型禽流感病毒多為低致病性毒株,主要引起產(chǎn)蛋下降或呼吸道癥狀。近年來,禽流感在野生鳥類、動物園珍禽中也有暴發(fā)的情況[1-2],不僅加大了珍禽保護(hù)的難度,同時也對動物園的游客和工作人員健康造成了一定威脅。因此研究適用于珍禽禽流感的免疫技術(shù)不僅關(guān)系到珍禽保護(hù)工作,也關(guān)系到公共衛(wèi)生安全。目前我國沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感的防控只能使用家禽禽流感疫苗。但關(guān)于家禽禽流感疫苗用于珍禽的安全性及免疫效果國內(nèi)外研究報道的較少,因此本實驗對成都動物園的多種珍禽進(jìn)行了家禽禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗的免疫試驗,并定期采血檢測其血清中HI抗體效價,評價免疫效果,為制定珍禽的禽流感免疫技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗疫苗 禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗,批號:2009008,哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗動物 成都動物園圈養(yǎng)的15種珍禽(孔雀、原雞、白鷴、七彩山雞、藍(lán)馬雞、白冠長尾雉、東方白鸛、丹頂鶴、禿鷲、綠頭鴨、黑天鵝、斑頭雁、黃鴨、鴛鴦、鸚鵡)。

1.1.3 檢測試劑 禽流感H5亞型抗原、陽性血清(批號分別為 200901、200801);禽流感H9亞型抗原、陽性血清(批號分別為07102101、080305),均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.4 1%紅細(xì)胞懸液 采集3只SPF公雞血液與等體積阿氏液混合,用pH值7.2的0.01mo1/L PBS液離心洗滌3次,洗滌后用PBS液配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 用禽流感疫苗免疫成都動物園圈養(yǎng)的15種珍禽,根據(jù)品種、年齡的不同,分別于胸肌或頸部皮下注射0.3-1.0mL/羽,所有免疫珍禽都套上腳標(biāo),做好編號。

1.2.2 血清采集 分別在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d翅靜脈采血,待血清析出后,8 000r/min離心4min,吸出血清并編號,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測 參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936-2003)所規(guī)定的方法,分別用禽流感H5亞型和H9亞型HI標(biāo)準(zhǔn)抗原,進(jìn)行免疫抗體水平檢測。

1.2.4 結(jié)果判定 以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價,只有陰性對照孔效價不大于2 log2,陽性對照孔效價誤差不超過1個log2時,試驗結(jié)果才有效。參照農(nóng)業(yè)部發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《高致病性禽流感—免疫技術(shù)規(guī)范》,禽流感HI效價4 log2判為免疫合格。

2 結(jié) 果

2.1 用禽流感(H5+H9)二價滅活苗免疫動物園圈養(yǎng)的15種珍禽后,其飲水、采食及精神狀態(tài)均正常。

2.2 15種珍禽群體H5亞型禽流感HI抗體平均水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分別為1.92 log2、4.90 log2、7.21 log2、5.80 log2 和 5.02 log2;H5亞型抗體合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分別為 25%、62.29%、91.67%、70.83%和70.83%,H5亞型禽流感抗體水平在21d達(dá)到高峰,35d時抗體水平已開始下降,其中七彩山雞、丹頂鶴、黃鴨平均抗體水平已下降到4 log2以下。孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產(chǎn)生抗體水平較好,而白冠長尾雉、黃鴨等產(chǎn)生抗體較差,鴛鴦始終沒有檢測出H5亞型抗體。結(jié)果詳見表1。

2.3 15種珍禽群體H9亞型禽流感HI抗體水平在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d分別為2.06 log2、7.73 log2、7.65 log2、7.10 log2 和 6.38 log2,H9亞型抗體合格率在免疫前及免疫后14d、21d、35d、90d 分別為 29.17%、95.83%、95.83%、91.67%和85.42%,H9亞型抗體水平在免疫后14d達(dá)到高峰,到90d群體抗體水平均維持在6 log2以上。孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產(chǎn)生抗體水平較高,而白冠長尾雉、鴛鴦、鸚鵡等產(chǎn)生抗體較差。結(jié)果詳見表2。

表1 免疫珍禽H5亞型禽流感HI抗體檢測結(jié)果

表2 免疫珍禽H9亞型禽流感HI抗體檢測結(jié)果

3 討論與分析

3.1 當(dāng)前疫苗免疫仍然是禽流感防制的主要措施。國內(nèi)目前沒有專門用于珍禽的禽流感疫苗,珍禽禽流感防控是采用家禽疫苗,而家禽疫苗用于珍禽免疫的安全性和免疫效果國內(nèi)僅有零星的研究報道,由于試驗樣本及試驗條件的差異,各家得出的結(jié)論也不盡一致[3-8]。有些珍禽如東方白鸛、綠頭鴨、白冠長尾雉等國內(nèi)尚無研究報道。本次試驗采用禽流感(H5+H9)二價滅活苗對動物園圈養(yǎng)的15種珍禽進(jìn)行免疫,免疫試驗期內(nèi),未出現(xiàn)免疫副反應(yīng),可見家禽禽流感疫苗用于珍禽免疫是安全的,這與梁少良、吳艷云等人的報道是一致[3,5]。

3.2 免疫的15種珍禽(除鴛鴦外)都能同時產(chǎn)生H5和H9亞型HI抗體。珍禽群體H5亞型HI抗體免疫后14d即可達(dá)到4.9 log2,免疫后21d達(dá)到高峰,為7.21 log2,孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產(chǎn)生抗體水平較好,而白冠長尾雉、黃鴨等產(chǎn)生抗體較差,鴛鴦始終沒有檢測出H5亞型抗體;H9亞型HI抗體14d達(dá)高峰,為7.73 log2,之后能維持較長的時間,孔雀、原雞、白鷴、斑頭雁等產(chǎn)生抗體水平較高,而白冠長尾雉、鴛鴦、鸚鵡等產(chǎn)生抗體較差。試驗結(jié)果比吳艷云、梁少良和姜北宇等人報道的免疫效果更好[3-5],這可能與免疫的珍禽的品種、免疫劑量以及免疫前動物群體的基礎(chǔ)抗體水平有關(guān)。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)東方白鸛不同個體對禽流感(H5+H9)二價滅活苗的不同亞型抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)差別較大,免疫的三只東方白鸛中有兩只產(chǎn)生了H5亞型禽流感HI抗體和H9亞型禽流感HI抗體,有一只卻只產(chǎn)生了H9亞型禽流感HI抗體;兩只鸚鵡也是對禽流感(H5+H9)二價滅活苗的不同亞型抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)差別很大,兩只鸚鵡沒有產(chǎn)生H5亞型禽流感HI抗體,卻能產(chǎn)生較好的H9亞型禽流感HI抗體。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因還有待進(jìn)一步研究。

3.3 本次試驗在國內(nèi)首次應(yīng)用禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗對動物園圈養(yǎng)珍禽進(jìn)行免疫試驗研究,其中對東方白鸛、綠頭鴨、白冠長尾雉的免疫研究在國內(nèi)屬首次報道,試驗結(jié)果對制定國內(nèi)動物園珍禽禽流感免疫技術(shù)具有重要的借鑒意義。

3.4 現(xiàn)已證實禽流感病毒廣泛分布于世界范圍內(nèi)的許多家禽和多種鳥類,覆蓋22科88種,其中主要有雁形目、鸻形目、雀形目中野鳥。各種野鳥尤其是野生水禽是禽流感病毒的主要儲存宿主,所有16種HA亞型(除H13亞型病毒僅在海岸鳥和鷗類中發(fā)現(xiàn))和9種NA亞型的病毒都可以在野生水禽中分離出[9-11]。動物園是各種鳥類聚集的地方,也是人類與珍禽接觸的主要場所,各種鳥類的匯聚為禽流感病毒的基因重排及基因變異創(chuàng)造了有利環(huán)境,增加了禽流感流行的風(fēng)險,因此做好禽流感的防控工作可以有效保護(hù)動物園的珍禽,同時對公共衛(wèi)生安全具有重要意義。此次珍禽禽流感二價疫苗免疫試驗表明,大部分珍禽能產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng),但品種間,品種內(nèi)個體間珍禽對疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)差別較大。因此,對動物園珍禽禽流感的防控除應(yīng)切實做好疫苗免疫接種工作,并定期監(jiān)測抗體水平,對抗體水平低的珍禽及時加強免疫,從而有效降低其易感性;同時,動物園還應(yīng)做好消毒工作,尤其是對于外來野鳥飛入動物園內(nèi)部?？康牡攸c應(yīng)加強消毒工作。此外,還應(yīng)加強動物園野生動物的疫病監(jiān)測,對于剛引進(jìn)的珍禽還應(yīng)做好檢疫、隔離工作?？傊?對動物園珍禽禽流感的防控須采取綜合防控措施。

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