劉紅亮,陳學(xué)忠,李克生,杜惠芬,陳應(yīng)泰,連曉雯,魯學(xué)萍,袁 明,葉文華

2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,蘭州 730050;

3.蘭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,蘭州 730030

腸出血性大腸桿菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鑒定及間接ELISA法的建立

劉紅亮1,陳學(xué)忠2,李克生2,杜惠芬2,陳應(yīng)泰3,連曉雯2,魯學(xué)萍1,袁 明2,葉文華2

目的提取并純化具有強免疫反應(yīng)性和高特異性的腸出血性大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)脂多糖(LPS)抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗體檢測中的應(yīng)用。方法應(yīng)用熱酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同時收集水相和酚相LPS,并對其產(chǎn)率、純度及免疫反應(yīng)性進行分析比較,用酸解法制備O-特異性多糖(O-SP),并以不同的LPS為包被抗原,建立間接ELISA法檢測E.coliO157∶H7 LPS抗體。結(jié)果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS優(yōu)先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,與水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反應(yīng)性和純度,酚相LPS經(jīng)酸解去脂得到的O-SP具有更高的反應(yīng)特異性。結(jié)論酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗體的ELISA檢測,O-SP具有更高的特異性,是檢測E.coliO157∶H7 LPS特異性抗體的理想材料。

大腸桿菌 O157∶H7;熱酚水法;脂多糖;O-SP;間接 ELISA

2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院,蘭州 730050;

3.蘭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,蘭州 730030

腸出血性大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)是一種嚴重危害人類健康的食源性病原菌,由于其具有高致病性和高毒力,近年來被公眾所關(guān)注。脂多糖(LPS)是E.coliO157∶H7細胞壁的重要組成部分,由類脂A、核心多糖和O特異性多糖(OSP)組成,E.coliO157∶H7的特異性O(shè)抗原位于LPS的O-SP上。該菌感染患者,可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗O157抗體[1],LPS抗原可用于對E.coliO157的血清學(xué)診斷[2],另外E.coliO157 LPS也被廣泛地應(yīng)用于E.coliO157特異性單克隆抗體的制備[3-4]。制備高質(zhì)量的E.coliO157∶H7 LPS抗原并建立靈敏度高、特異性強的針對E.coliO157∶H7 LPS抗體的ELISA檢測方法是對該菌進行血清學(xué)診斷及制備E.coliO157∶H7 LPS特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)。針對國內(nèi)實驗室在熱酚水法中對酚相LPS的忽視,本實驗在常規(guī)熱酚水法的基礎(chǔ)上同時收集了水相和酚相LPS,分別對其性質(zhì)進行分析研究,并初步建立了E.coliO157∶H7 LPS抗體的間接ELISA檢測方法。

1 材料

1.1 菌種及抗體 大腸桿菌O157∶H7(NCTC 12900)菌種由珠海出入境檢疫局提供,E.coliO157∶H7 LPS單克隆抗體4B2(McAb4B2)和單克隆抗體7F9(McAb7F9)及鼠E.coliO157∶H7高免血清由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)生物中心提供,兔E.coliO157診斷血清由蘭州生物制品研究所提供。

1.2 主要生化試劑 苯酚、蒽酮、高碘酸、聚乙二醇20 000、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純;胰蛋白胨、酵母抽提物(OXOID公司);牛血清白蛋白(BSA)(北京利科恒達科貿(mào)有限公司);十二烷基磺酸鈉(SDS)、T ris堿(華美公司);丙烯酰胺、雙丙烯酰胺(Merck公司);辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG(羊抗鼠IgG-HRP)、羊抗兔IgG-HRP(北京博奧森生物制品有限公司);堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG(羊抗鼠IgG-AP)(sigma公司);Hybond c-Extra硝酸纖維素(Amersham Biosciences公司);5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(BCIP/NBT)底物(Promega公司)。

1.3 儀器設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋(北京長風(fēng)儀器儀表公司),酶標檢測儀(T hermo Labsystems),洗板機(Thermo Labsystems),低溫冷凍離心機(Beckman),高速離心機(Eppendorf),電泳儀、垂直板槽(bio-rad),UV-120-2紫外可見風(fēng)光光度計(shimadzu),超聲波破碎儀(上海之信儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 菌體制備 取E.coliO157∶H7菌種劃線接種于LB平板培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)15h,挑取單個典型菌落接種于1 000mL LB培養(yǎng)基,37℃,200r/min搖床培養(yǎng)24h,然后 80℃,30min滅活,離心收集菌體,用滅菌0.9%NaCl洗滌3次,稱菌體濕重,加入4倍重量的去離子水,懸起細菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 LPS制備 熱酚水法參考Westerman等[4]并做適當改進。菌懸液反復(fù)凍融4次,然后超聲破碎,水浴加熱至72℃,與等體積72℃的88%的苯酚混合,72℃水浴30min,每隔數(shù)分鐘劇烈攪拌一次,取出冷卻至室溫,3 000 r/min離心20min。收集上層水相,下層酚相加等體積去離子水重復(fù)抽提1次。合并水相,加入10mL 88%苯酚重復(fù)抽提1次。棄去中層變性蛋白,分別收集酚相和水相,然后流水透析48h去酚,去離子水透析24h,4～5h換水1次,用25%聚乙二醇20 000濃縮至原體積的1/4,離心棄沉淀。上清加入無水乙醇使其終濃度為25%,4℃過夜,12 000r/min離心20min,棄去核酸沉淀。上清中繼續(xù)加入無水乙醇使其終濃度為85%,用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.5～9.0,4℃靜置2h,8 000r/min離心20min,收集沉淀稱重,分別用去離子水溶解沉淀,使產(chǎn)物的濃度為10mg/mL,標記為酚相LPS和水相LPS,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 O-SP的制備 酚相LPS溶液中加入冰醋酸使其終濃度為2%,100℃水浴1h,12 000r/min離心20min,棄沉淀(類脂),取上清,去離子水透析24h去酸,25%聚乙二醇20 000濃縮至原體積,標記為O-SP,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 多糖含量的測定 蒽酮-硫酸法測定LPS糖含量,以葡萄糖為標準品繪制標準曲線。

2.5 蛋白含量的測定 Bradford法測定,以BSA為標準品制作濃度標準曲線。

2.6 SDS-PAGE電泳分析及Western-blot鑒定

2.6.1 SDS-PAGE 濃縮膠為 4%,分離膠為12%,采用 2.5μ g 、5μ g 和 10μ g 三個上樣量 ,60V 電壓直至樣品進入分離膠,然后以150V電泳至溴酚藍遷移到分離膠末端。LPS銀染方法參考徐先棟等[5]方法。

2.6.2 Western-blot 20μ g的酚相 LPS進行SDS-PAGE電泳,然后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素薄膜上(200mA,電轉(zhuǎn)印60min),電轉(zhuǎn)移后將膜于含5%脫脂奶粉的 TBST(20mmol/LTris-Cl,pH7.4,150mmol/L NaCl,0.5%Tween-20)溶液中室溫封閉1 h,TBST洗3次(每次5min);將膜分別浸于McAb4B2腹水(1∶200稀釋,稀釋液為含5%脫脂奶粉的TBST溶液)和McAb7F9腹水(1∶200稀釋),室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次(每次5min);加二抗(1∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG-AP,稀釋液為含5%脫脂奶粉的TBST溶液),室溫輕搖1 h,TBST洗膜3次(每次 5min);加入 BCIP/NBT顯色液(用前現(xiàn)配),室溫下避光顯色,蒸餾水終止反應(yīng)。

2.7 瓊脂糖凝膠電泳 應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠(含0.5μ g/mL溴化乙錠)對LPS樣品進行電泳分析,5μ L LPS樣品加入1μ L loading buffer,80V 恒壓電泳20min后在紫外下進行觀察。

2.8 間接ELISA法檢測E.coliO157:H7 LPS抗體 間接ELISA檢測方法參考照文獻[6],用方陣滴度法確定抗原包被濃度和酶稀釋度,用酚相、水相LPS和O-SP包被酶標板,檢測E.coliO157:H7鼠高免血清、兔E.coliO157診斷血清及E.coliO157 LPS單克隆抗體。

3 結(jié) 果

3.1 LPS產(chǎn)率 菌體濕重4g,純化后得到水相LPS 28mg、酚相 LPS 13mg,總產(chǎn)率為1.025%。

3.2 LPS多糖含量 采用苯酚一硫酸法以葡萄糖為標準品制作標準曲線:y=122.7x-2.565(R2=0.994),x為A 值(OD580),y為糖含量(μ g/mL),檢測樣品A值經(jīng)計算水相LPS溶液和酚相LPS溶液糖含量分別為690μ g/mL 和1 870μ g/mL,水相LPS和酚相LPS沉淀中含糖量分別為6.9%和18.7%。

3.3 LPS蛋白含量 Bradford法測定,以BSA為標準品制作濃度標準曲線:y=1020x+2.023(R2=0.988),x為A值(OD590),y為蛋白含量(μ g/mL),檢測樣品A值經(jīng)計算水相LPS溶液和酚相LPS溶液蛋白含量分別為 180μ g/mL 和 56μ g/mL,水相LPS和酚相LPS沉淀中蛋白含量分別為1.8%和0.56%。

3.4 SDS-PAGE電泳銀染及Western-blot結(jié)果

圖1為銀染和免疫印跡結(jié)果。從圖中可以看出,E.coliO157∶H7 LPS SDS-PAGE電泳程典型的階梯狀條帶在10-60kd之間都有分布,其中在35-60kd和10-20kd有集中分布。大分子量的E.coliO157∶H7 LPS主要分布于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS。Western-blot結(jié)果顯示,大分子量LPS和小分子量LPS都能與核心抗原單克隆抗體(McAb4B2)結(jié)合,然而只有具有大片段O-側(cè)鏈的LPS與O-特異性多糖單克隆抗體(McAb7F9)有良好的反應(yīng)性。

圖1 LPS銀染與免疫印跡結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis and Western-blot analysis of LPS

3.5 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 圖2為LPS瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,從圖中可以看出,水相LPS中含有大量的長度在100bp左右的小片段核酸,酚相LPS中只含有少量的核酸,經(jīng)酚相LPS酸解得到的O-SP幾乎不含核酸雜質(zhì)。

圖2 LPS樣品瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose Gel Electrophoresis analysis of LPS

3.6 ELISA檢測結(jié)果 將水相LPS、酚相LPS、OSP稀釋至 1μ g/mL包被酶標板,相當于每孔0.1μ g/mL,羊抗鼠IgG-HRP最佳稀釋度為1∶40 000,羊抗兔IgG-HRP最佳稀釋度為1∶20 000,檢測鼠高免血清、兔E.coliO157診斷血清及E.coliO157∶H7 LPS單克隆抗體結(jié)果見表1。

4 討 論

熱酚水法由于操作簡單,經(jīng)進一步純化后可得到純度較高的 LPS,因此被大多數(shù)實驗室所采用,但是國內(nèi)實驗室普遍存在對酚相LPS忽略的問題,因此本實驗分別收集了酚相和水相LPS,并分別對其特性進行研究和討論。

本實驗水相LPS和酚相 LPS的收率分別為0.7%和0.325%,總收率為1.025%,高于宋宏新[7]等0.5%的收率,本實驗不僅收集了水相LPS也收集了酚相LPS,因此總收率有明顯的提高,除此之外雜質(zhì)含量、菌種及培養(yǎng)條件也對收率有一定影響。本實驗采用乙醇分級沉淀法去除核酸雜質(zhì),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示該方法不能有效除去水相中長度在100bp左右的小片段核酸,宋宏新[7]等利用酶解法除去核酸雜質(zhì),雖然可以有效除去核酸,但是會增加LPS中的蛋白含量,同時也增加了生產(chǎn)成本。潘勁草[8]等利用超速離心法也可除去核酸,但是超速離心對實驗設(shè)備要求較高,不利于該實驗在大多數(shù)實驗室展開。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果還表明核酸主要溶于水相,酚相中只含有少量核酸雜質(zhì),實驗結(jié)果也證實經(jīng)乙醇分級沉淀法除去核酸的酚相LPS可以滿足檢測的需要,并且在酚相LPS經(jīng)酸解去脂得到的O-SP中沒有檢測出核酸。

有研究認為在用熱酚水法提取E.coliO157LPS時LPS主要溶于水相[8],本實驗中SDS-PAGE銀染結(jié)果顯示大分子量的光滑型LPS(S-LPS)主要分布于酚相,粗糙型LPS(R-LPS)以及O-側(cè)鏈寡糖重復(fù)單位較少的LPS在水相和酚相都有分布,并且在水相分布要多于酚相,該結(jié)果與Kim等[9]的報道相一致。Western結(jié)果表明,大分子量LPS和小分子量LPS都能與核心抗原單克隆抗體4B2結(jié)合,然而只有O-側(cè)鏈具有一定數(shù)量寡糖重復(fù)單位的 LPS才與O-特異性多糖單克隆抗體7F9有良好的反應(yīng)性,LPS western結(jié)果與抗體的性質(zhì)有很大的關(guān)系,該結(jié)果與Westerman[4]等的報道相一致。

表1 以不同LPS為包被抗原間接ELISA檢測結(jié)果Table 1 Result of Indirect ELISA with different LPS as antigen

從 ELISA結(jié)果可以看出,水相 LPS用于ELISA檢測效果不如酚相LPS和O-SP。本實驗所采用的間接ELISA是將LPS抗原包被于聚苯乙烯酶標板,LPS與聚苯乙烯酶標板的吸附性是進行ELISA檢測的基礎(chǔ),有報道[10]稱多S-LPS按常規(guī)方法包被能吸附到聚苯乙烯板上,然而R-LPS不能很好吸附于酶標板,在酶聯(lián)反應(yīng)各步中按常規(guī)方法會逐步將 LPS洗掉。水相LPS主要成分就是 RLPS和O側(cè)鏈只有較少寡糖重復(fù)單位的LPS,因此水相LPS與聚苯乙烯酶標板結(jié)合力差是影響其檢測結(jié)果的主要因素,Appelmelk[11]也曾報道其采用R-LPS與牛血清白蛋白(BSA)復(fù)合物進行包被可極大地提高R-LPS的檢測靈敏度。核酸電泳結(jié)果顯示在水相LPS中含有大量100bp左右的核酸分子,核酸雜質(zhì)含量高也可能是影響水相LPS檢測結(jié)果的因素之一。酚相LPS和O-SP,并表現(xiàn)出了較高的免疫反應(yīng)性和靈敏度,說明聚苯乙烯酶標板對酚相LPS和O-SP具有較好的吸附性,同時也說明由熱酚水法制的的酚相LPS具有很好的免疫反應(yīng)性。對兩株單抗的檢測結(jié)果顯示,酚相LPS經(jīng)酸解去脂后不影響其與O-特異性多糖單克隆抗體的反應(yīng),而不能與核心抗原單克隆抗體發(fā)生反應(yīng),因此O-SP具有更高的反應(yīng)特異性。

脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁外膜中的重要組成成分,其不僅在細菌感染及疾病演化中具有重要作用,而且是革蘭陰性菌重要的表面抗原,因此,近年來有關(guān)LPS的研究備受關(guān)注。本實驗對常規(guī)熱酚進行了改進,并制備了E.coliO157∶H7 LPS,并用酸解法制備了O-SP,ELISA結(jié)果顯示酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗體的檢測,其中O-SP具有更高的反應(yīng)特異性。

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Extraction and identification ofE.coliO157∶H7 lipopolysaccharide and development of an indirect ELISA

LIU Hong-liang,CHEN Xue-zhong,LI Ke-sheng,DU Hui-fen,CHEN Ying-tai,LIAN Xiao-wen,
LU Xue-ping,YUAN Ming,YE Wen-hua
(School of Life Sciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

To obtain lipopolysaccharide(LPS)ofEscherichiacoliO157:H7(E.coliO157:H7)and study the application of LPS in detection of anti-O157:H7 LPS antibody,in the present study the LPS was extracted fromE.coliO157:H7 by the hot phenol-water method and both the aqueous and phenol phases were collected.The yield,purity and immunoreactivity had been investigated,and then the phenol phases LPS was hydrolyzed by acetic acid for getting O-Specific Polysaccharide(O-SP).Indirect ELISA with different LPS as antigen was performed to detect anti-O157:H7 LPS antibodies.The results showed that the high molecular mass LPS was preferentially extracted by the phenol phase,and the aqueous phase contained more low molecular mass LPS.Compared with aqueous phases LPS,the phenol phases LPS has higher purity and immunoreactivity.O-SP has higher reaction specificity,it could be used to detect antibodies ofE.coliO157:H7 LPS.

E.coliO157:H7;hot phenol-water method;LPS;O-SP;indirect ELISA

R378.2

A

1002-2694(2011)07-0637-04

陳學(xué)忠,Email:chief.chenxuezhong@163.com

1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730030;

2011-01-09;

2011-04-26