王 維,鄭勝生,祁 瑤,聞惠琴,劉麗麗,沈繼龍

IL-13細胞因子主要由活化 Th2細胞分泌[1],其功能具有多效性,IL-13表達異常與抗感染、腫瘤生長、哮喘發(fā)作、炎性損傷及組織修復等密切相關。作為Th2優(yōu)勢應答重要調節(jié)因子,IL-13已成為哮喘、特發(fā)性肺纖維化、潰瘍性結腸炎等疾病重要治療靶標。IL-13有親合力和功能截然不同的二種受體:IL-13Rα 1和IL-13Rα 2,后二者氨基酸序列37%同源性。單獨 IL-13Rα 1呈IL-13低親合力;當 IL-13Rα 1與IL-4α結合形成異二聚體,則形成高親合力的功能受體,促使IL-13發(fā)揮生物學效應[2]。相反,IL-13Rα 2與 IL-13的結合能力是 IL-13Rα 1的50倍,由于胞漿區(qū)僅含17個氨基酸,無結合JAK/STAT模序,不能啟動IL-13-STAT6纖維化信號通路,從而行使“誘騙”IL-13作用,故 IL-13Rα 2又稱“誘騙受體(decoy receptor)”[3-4]。

近年有關IL-13Rα 2在曼氏血吸蟲病、哮喘等Th2免疫相關疾病中的作用已引起廣泛關注。Mentink等報道曼氏血吸蟲感染機體(患者和模型動物)血清IL-13Rα 2蛋白水平升高,且與肉芽腫體積相一致,IL-13Rα 2具有下調血吸蟲病肉芽腫炎癥反應,延長感染鼠壽命等作用[5]。鑒于Th2細胞因子必須通過細胞膜上受體傳遞信號級連,而關于血吸蟲病IL-13Rα 2的細胞起源尚不清楚,本研究以感染日本血吸蟲BALB/c鼠為模型,利用免疫熒光染色技術,檢測肝肉芽腫和原代巨噬細胞IL-13Rα 2蛋白的表達情況,為進一步探討血吸蟲病等Th2型免疫疾病分子病理機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與釘螺 5～6周齡BALB/c鼠購自中國科技大學實驗動物中心。陽性釘螺購自無錫江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(HyClone)、RPMI1640(Gibco)、多克隆羊抗鼠 IL-13Rα 2 IgG(R&D)、鼠抗CD68單克隆抗體(ED1,AbD Serotec)、羊抗鼠IgG(Jakson)、Cy3標記驢抗羊 IgG和FITC標記兔抗小鼠IgG抗體(Sigma);熒光顯微鏡(Nikon80i)、激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS sp5)、細胞培養(yǎng)箱(BioTech)、超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.3 血吸蟲病模型鼠的建立 雌、雄健康BALB/c鼠各30只,隨機分成感染組和對照組。感染組鼠:活尾蚴25±2條經腹部皮膚攻擊;對照組鼠:不予攻擊。清潔級飼養(yǎng),實驗流程和小鼠處理過程遵循實驗動物管理規(guī)范條例。

1.4 肝組織免疫組化染色 獲取感染8周鼠肝臟,常規(guī)制片、脫臘,PBS洗滌;檸檬酸緩沖液抗原修復后;滴加5%羊血清,37℃恒溫水箱孵育30min,加入羊抗鼠 IL-13Rα 2抗體(1∶200),4℃過夜;次日,滴加Cy3標記驢抗羊IgG(1∶500),室溫1h,洗滌;滴加4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色細胞核(50μ g/mL),室溫避光顯色5min,甘油覆蓋封片,熒光鏡下觀察、拍照及軟件分析。對照組一抗用羊抗鼠IgG(1∶200)。

1.5 原代巨噬細胞分離、培養(yǎng) 于感染8周時,眼球放血、頸椎脫臼處死小鼠,75%乙醇浸泡消毒后,置超凈臺無菌條件下每只鼠腹腔注射冰0.01mol/L PBS 5 mL,輕揉腹部,收集灌洗液,250g×10min,棄上清;收集沉淀細胞,用含青、鏈霉素10%FCS/RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸之,細胞計數(shù)并調整為1×106/mL單細胞懸液;多聚賴氨酸包被及貼壁法純化細胞:24孔細胞培養(yǎng)板每孔預先滴加0.1%多聚賴氨酸0.2mL,半小時后去除多聚賴氨酸、晾干、待用。滴加1mL單細胞懸液/孔,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2h后換液并棄除未貼壁細胞,每孔再補加完全培養(yǎng)液、繼續(xù)培養(yǎng),每天倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài);第5d取出培養(yǎng)板,部分細胞用于鑒定,其余細胞用于以下實驗。

1.6 細胞免疫熒光染色 取出第5d培養(yǎng)板,PBS輕微震蕩洗滌5min×2次;每孔加入4%多聚甲醛0.5mL,4℃30min,同上洗滌;0.1%BSA/0.1%皂素/PBS 4℃封閉1h,洗滌;滴加一抗:羊抗鼠 IL-13Rα 2 IgG(1∶200)和抗 CD68單克隆抗體 (1∶100),4℃過夜;次日洗滌后,滴加相應熒光二抗:Cy3標記驢抗羊IgG(1∶500)和FITC標記兔抗小鼠 IgG(1∶200),室溫孵育1h,洗滌;加入DAPI對照組一抗用羊抗鼠IgG。

1.7 結果分析 選擇激發(fā)波長為330nm,發(fā)射波長為 420nm;激發(fā)波長為 490nm,發(fā)射波長為520nm;激發(fā)波長為510nm,發(fā)射波長為575nm的濾片,熒光顯微鏡下分別對 DAPI(藍色)、Cy3(紅色)、FITCI(綠色)熒光標記結果進行觀察、拍攝圖像,軟件疊加獲得組合圖像。陽性標準:藍色熒光觀察細胞核(DAPI標記),紅色熒光為 IL-13Rα 2(Cy3標記)反應信號,綠色熒光為ED1(FITCI標記)陽性反應,淺黃色熒光是疊加圖像(綠色加紅色)為CD68與IL-13Rα 2同一部位共表達的信號。

2 結 果

2.1 感染鼠肝肉芽腫表達IL-13Rα 2蛋白 肝組織切片熒光染色結果如圖1A-C:橢圓形肉芽腫病灶與正常組織形成明顯界線,蟲卵位于中央,周圍可見大量圓形或新月形蘭色熒光即細胞核,圖1A;觀察同一視野下相應的IL-13Rα 2-Cy3染色,病灶內可見多個散在分布的紅色“咖啡豆”,為特異性IL-13Rα 2抗體免疫反應陽性信號,圖1B;二者疊加的圖像顯示,該陽性信號主要位于細胞漿,圖1C,因此日本血吸蟲病肉芽腫內存在IL-13Rα 2陽性表達的細胞。

2.2 巨噬細胞表達IL-13Rα 2蛋白

2.2.1 細胞鑒定 為證實巨噬細胞是IL-13Rα 2陽性表達的細胞,體外分離小鼠(感染8周)腹腔細胞,倒置顯微鏡下觀察:12h部分細胞開始伸展、出現(xiàn)偽足;2d大部分細胞已伸展,呈星形、三角形,5d細胞生長狀態(tài)如圖2所示,正常鼠細胞數(shù)較少,圖2A;感染鼠細胞數(shù)較多,圖2B;光鏡下感染組與對照組巨噬細胞形態(tài)、伸展、貼壁等無明顯差異。細胞免疫熒光染色法結合激光共聚焦顯微鏡觀察:全部細胞呈綠色熒光,表明貼壁法已獲得高純度巨噬細胞,圖2C。

2.2.2 血吸蟲病巨噬細胞增強表達IL-13Rα 2蛋白熒光鏡下觀察,血吸蟲感染鼠腹腔巨噬細胞沿胞膜內緣可見一明亮紅色環(huán)圈,圖3A2;而正常對照鼠細胞同樣部位未見明顯的紅色環(huán)圈,圖3B2;陰性抗體對照組均未見紅色熒光信號,圖3C2,表明血吸蟲感染誘導機體巨噬細胞增強表達IL-13Rα 2。

2.2.3 CD68與IL-13Rα 2細胞共表達 熒光鏡下DAPI標記細胞核呈藍色熒光(圖3A1、B1、C1),正常和感染鼠巨噬細胞胞質均可見CD68陽性染色,圖3A3、B3;感染鼠巨噬細胞胞質中可見明顯IL-13Rα 2陽性染色(紅色熒光),圖3A2;組合圖像呈淺黃色提示感染鼠IL-13Rα 2與CD68蛋白共表達,圖3A4。

3 討 論

誘騙受體 IL-13Rα 2基因結構高度保守,人、鼠序列同源性 59%,鼠 IL-13Rα 2 ORF 1 149bp,編碼383個氨基酸,由胞外、跨膜和胞漿三個部分組成。IL-13Rα 2具有N端纖維連接蛋白樣區(qū)域,4個保守的半胱氨酸殘基,其胞外區(qū)含有促紅細胞生成素受體家族保守模序WSXWS[2]。IL-13Rα 2蛋白有三種存在形式:外分泌型蛋白sIL-13Rα 2(soluble IL-13 receptor alpha 2)分子量45kD～50kD[6],以可溶性形式存在于血、尿中;膜結合型蛋白位于細胞膜上;胞漿型蛋白分布細胞質中,為主要存在形式?？扇苄?sIL-13Rα 2-Fc(soluble IL-13 receptor alpha 2-Fc)蛋白可通過基因重組等技術獲得,已成為IL-13高親和力拮抗劑用于IL-13活性干預及其生物學效應等研究[7]。誘騙受體IL-13Rα 2雖能強力結合IL-13,但不能傳導信號,已成為研究感染免疫、腫瘤等“熱點分子”。IL-13Rα 2基因敲除鼠(IL-13Rα 2-deficient mice,IL-13Rα 2-/-)感染曼氏血吸蟲后肝纖維化程度加重,給予注射sIL-13Rα 2-Fc后可得到改善,表明纖維化程度與IL-13活性增高有關[8]。更有意義的是,對某些高表達IL-13受體的腫瘤細胞,利用拮抗劑sIL-13Rα 2的受體定點靶向作用,實現(xiàn)對腫瘤細胞的特異性“殺死”,目前IL-13Rα 2腫瘤基因治療已進入臨床前期實驗[9]。

鼠血吸蟲病已成為Th2型免疫疾病研究的理想模型,在 IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等多種 Th2 細胞因子中,IL-13是最重要的介質[4,10]。巨噬細胞作為肉芽腫重要組成細胞,約占總數(shù)25%～30%[11],是機體與蟲卵抗原最先直接接觸的細胞[12],也是產生Th2應答所必須的條件[13]。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝肉芽腫內巨噬細胞發(fā)生一系列超微結構的變化,感染6周的胞漿內出現(xiàn)大吞噬體,提示吞噬活動增強;感染8周粗面內質網增加,表明其蛋白合成能力增強[14]。

目前有關血吸蟲和IL-13Rα 2的研究主要見于曼氏血吸蟲病,日本血吸蟲病和IL-13Rα 2的相關文獻報道少見,然而日本血吸蟲病肉芽腫等病理損傷較曼氏血吸蟲病更為嚴重。此前我們已報道,日本血吸蟲感染誘導機體IL-13Rα 2基因轉錄增強和血清IL-13Rα 2水平升高[15]。CD68是110kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要位于胞質,為巨噬細胞特征標志蛋白[16]。本研究采用免疫熒光標記技術,原位顯示肝肉芽腫和原代巨噬細胞IL-13Rα 2基因表達產物,DAPI染色顯示細胞核,再通過疊加的圖像檢測該蛋白亞細胞分布情況。該研究的結果表明,血吸蟲病肝肉芽腫IL-13Rα 2蛋白異常增高,巨噬細胞是IL-13Rα 2陽性表達細胞。關于血吸蟲感染誘導巨噬細胞增強表達誘騙受體IL-13Rα 2及其對炎性肉芽腫免疫病理調節(jié)作用有待后續(xù)研究。

圖3 三重免疫熒光標記法檢測血吸蟲病巨噬細胞CD68/IL-13Rα 2蛋白(×400)Fig.3 Tristain immunofluorescence on the detection of CD68/IL-13Rα 2 protein(×400)

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