張 玉

（安徽省寧國(guó)市畜牧獸醫(yī)局，寧國(guó) 242300）

目前，世界稻谷年產(chǎn)量已達(dá)5億 t左右。米糠是禾本科植物稻谷的外殼，是碾米過(guò)程中被碾下的皮層及米胚和少量碎米的混合物，約占稻谷產(chǎn)量的5.0%～5.5%[1]。米糠作為一種產(chǎn)量大、綜合利用價(jià)值還不高的農(nóng)副產(chǎn)品，被聯(lián)合國(guó)工業(yè)發(fā)展組織稱為一種未充分利用的資源，其原因之一是缺乏相應(yīng)的理論和應(yīng)用研究[2]。很多種類的生物多糖都具有調(diào)節(jié)免疫作用，極具開(kāi)發(fā)潛力[3-6]。米糠它具有通腸、開(kāi)胃、下氣的作用，可用于治療腳氣、癌腫等[7-8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)米糠中含有纖維素、多糖等多種活性成分，利用米糠可提取米糠油、米糠營(yíng)養(yǎng)素、米糠營(yíng)養(yǎng)纖維、功能性多肽等[9]。在米糠多種加工產(chǎn)品中，米糠多糖具有良好的經(jīng)濟(jì)效益，可使米糠增值63倍，極大提高米糠價(jià)值[10]。諸多研究資料表明米糠活性成分在抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、抗細(xì)菌感染及降血糖等方面具有較高的生物活性[11]。

關(guān)于米糠多糖的提取方法，近年來(lái)主要是酶提法和超聲波提取法等，因?yàn)槌杀靖咚栽趯?shí)際生產(chǎn)中仍以水提法為主。目前，對(duì)于米糠多糖的提取主要采用熱水浸提法[2，12-14]。在浸提過(guò)程中部分可溶性淀粉（Starcky Saccharides）隨多糖被提取出來(lái)，可用淀粉酶去除。浸提后不溶物除去，上清液反復(fù)醇析得到米糠多糖的4種不同組分：RBSP、RBS30、RBS60、RBS8。本試驗(yàn)就熱水浸提法提取米糠多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行研究，試圖找出最佳的提取條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）、JFSD-100粉碎機(jī)（上海日暉微電機(jī)廠）、電子分析天平（上海精科天平總廠）、TDL-5-A轉(zhuǎn)速和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間控制離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、HH-S系列恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、玻璃儀器氣流烘干器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）、722S分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、TH2-82氣浴恒溫震蕩器（江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.1.2 試劑 乙醇（95%分析純，蚌埠化學(xué)試劑廠）、苯酚（上海海曲化工有限公司）、硫酸（分析純，南京化學(xué)試劑一廠）、淀粉酶（無(wú)錫星達(dá)生物工程有限公司）、無(wú)水葡萄糖（鄒平怡康集團(tuán)有限公司）。

1.3 原料及其選擇

米糠（市售）。有關(guān)資料表明，在相同的提取條件下，細(xì)糠的多糖得率遠(yuǎn)高于粗糠[15]。因此，選擇細(xì)糠作為試驗(yàn)的原料。

1.4 試驗(yàn)方法

將樣品按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料水比例置于三角瓶中并進(jìn)行密封恒溫浸提。將浸提液置于3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min后，取上清液加入3倍體積的95%乙醇溶液中，靜置12 h后再離心（3 000 r/min）20 min，沉淀物為多糖。由于在熱水浸提過(guò)程中，部分可溶性淀粉也隨多糖被提取出來(lái)，需要進(jìn)一步用酶法去除淀粉。按3U/g加淀粉酶到粗多糖溶液中，95 ℃水浴處理，碘反應(yīng)直到為陰性，然后再用95%乙醇處理，離心后去除上清夜，沉淀物加蒸餾水重溶解后供測(cè)定用。

1.5 米糠多糖測(cè)定方法

1.5.1 米糠多糖提取工藝流程

1.5.2 米糠多糖測(cè)定方法的選擇 本試驗(yàn)采用苯酚–硫酸法測(cè)定多糖含量。苯酚–硫酸法的原理是多糖類在硫酸的作用下，先水解成單糖分子，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚合成有色化合物，以比色法測(cè)定多糖含量[16]。

1.5.3 苯酚–硫酸法測(cè)定多糖

（1）用葡萄糖溶液作為對(duì)照樣測(cè)定不同葡萄糖溶液的吸光度，作出回歸曲線，求出回歸方程，待測(cè)樣品以同樣的方法測(cè)吸光度，對(duì)照。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液（0.1 mg/ml）0.10 ml、0.20 ml、0.30 ml、0.40 ml、0.50 ml，分別置于5 ml干燥試管中，各加水到1.00 ml，再分別加苯酚試劑0.50 ml，搖均，在冷水浴中迅速滴加2.50 ml硫酸，搖均，同時(shí)做一空白，按分光光度法于488 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

（3）多糖含量測(cè)定：精密吸取0.02 ml從米糠中提取的多糖溶液，置于5 ml試管中，加水至1 ml，加苯酚試劑0.50 ml，搖均，在冷水浴中加硫酸2.50 ml，置沸水浴上加熱5 min，冷卻至室溫，同時(shí)做一空白，在488 nm出進(jìn)行比色測(cè)定，得出相應(yīng)的吸光度。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

圖4 料水比對(duì)多糖提取率的影響

表1 試驗(yàn)因素水平

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

如果吸光度大于0.7或小于0.1，則另需減少或增加吸取試液量，保證讀數(shù)范圍在0.1和0.7之間。做3次平行測(cè)定。從回歸方程可求出試管中多糖的濃度，然后換算成一定質(zhì)量的米糠多糖提取率。

表3 方差分析表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖2可知，浸提時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的提取率越高。當(dāng)時(shí)間超過(guò)3 h，提取率增加量開(kāi)始減少，即是再延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取率也不會(huì)有較大增加。由于浸提時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加能源的消耗，從而增加成本，所以浸提時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。因此，取3 h、4 h、5 h作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.1.2 浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響 從測(cè)定結(jié)果圖3可看出，升高溫度有利于多糖得率的提高，為獲得較高的提取率，應(yīng)選擇較高的浸提溫度。當(dāng)溫度升高到100 ℃以上時(shí)，提取率隨溫度上升而升高，但增幅不大；當(dāng)溫度超過(guò)110 ℃時(shí)，不僅多糖的生物活性有可能會(huì)受到破壞，而且升高溫度會(huì)帶來(lái)能源消耗。綜合以上因素，選擇90℃、95 ℃、100 ℃作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.1.3 料水比對(duì)多糖提取率的影響 試驗(yàn)中有1∶5～1∶25五種料水比，結(jié)果表明多糖提取率隨加水量的增加而增加，因此，在一定范圍內(nèi)增加浸提加水量有助于提高米糠多糖提取率。如果繼續(xù)增加水量，提取率增幅不大。因此，1∶15、1∶20、1∶25三種料水比為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)，選擇料水比、浸提時(shí)間、浸提溫度3項(xiàng)作為考察因素，各取3個(gè)水平，采用L9（33）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

對(duì)提取米糠多糖的影響因素，如浸提溫度、浸提時(shí)間、料水比進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

極差大小可反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的程度，據(jù)表3方差分析，試驗(yàn)因素主次順序?yàn)椋航釡囟?、浸提料水比、浸提時(shí)間。

從正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可以看出，因素A（浸提溫度）以第3個(gè)水平105℃為最佳，因素B（浸提時(shí)間）以第3個(gè)水平4h為最好，因素C（料水比）以第2個(gè)水平1∶20為最好。因此最佳的組合為A3B3C2。

3 討論

米糠多糖主要存在于水稻穎果的稃片和穎片的細(xì)胞壁中，與纖維素、半纖維素、果膠等成分復(fù)雜結(jié)合，隨著提取溫度的升高，提取率也逐漸增加，各水平之間的差異較為顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明提取溫度以100 ℃最好，如果進(jìn)一步提高浸提溫度，多糖提取率還可有所提高，但是過(guò)高的溫度需要消耗更多的能源，多糖的提取率不會(huì)有相應(yīng)的提高，而且溫度過(guò)高還會(huì)破壞多糖的生物活性。因此在多糖的提取過(guò)程中要適當(dāng)?shù)乜刂茰囟?，溫度過(guò)高會(huì)消耗較多的能量，造成不必要的浪費(fèi)，溫度過(guò)低不能充分地提取米糠中的多糖。

料水比是影響多糖提取率的主要因素，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的3個(gè)水平之間達(dá)到了一般顯著水平。料水比以1∶20為最好。試驗(yàn)表明最佳浸提時(shí)間為4 h，在試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的3個(gè)水平之間達(dá)到了一般顯著水平，各水平之間的極差較小，準(zhǔn)確度較高。因此，本試驗(yàn)優(yōu)化出的米糠多糖的最佳提取工藝條件為：浸提溫度為100 ℃，料水比為1∶20，浸提時(shí)間為4 h。

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