郝立宏，楊曉燕,2，宮琳琳，趙瑾瑤，宋 陽，杜 莎，王 蘭，劉 鷺，熊 海,3

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116044; 2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 腫瘤科，遼寧 大連 116027; 3.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 胸外科，遼寧 大連 116001)

肺癌已成為中國惡性腫瘤的首位死亡原因，其發(fā)生是多基因參與的多階段、多步驟的復(fù)雜過程，是癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的結(jié)果。近年對(duì)腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因的失活在腫瘤中扮演越來越重要的角色。上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin,CDEH1)是介導(dǎo)同型細(xì)胞-細(xì)胞間粘附的鈣依賴性跨膜粘蛋白，具有腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移抑制功能，被認(rèn)為是腫瘤侵襲抑制因子[1]。研究表明E-cadherin在大多數(shù)腫瘤組織中呈低表達(dá)，成為預(yù)測肺癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)；啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是引起基因沉默的主要機(jī)制之一，可能影響基因功能的正常發(fā)揮[2]。本實(shí)驗(yàn)通過研究肺癌細(xì)胞株中E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，探討肺癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)改變的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 NCI-H460 及人肺腺癌細(xì)胞株 SPCA 和 A549 購自中國科學(xué)院腫瘤所細(xì)胞庫，經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)組胚教研室長期液氮保存。實(shí)驗(yàn)前，常規(guī)培養(yǎng)于含 10% 優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在 37℃、5%CO2的飽和濕度孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

E-cadherin 鼠抗人單克隆抗體、免疫組化SP超敏試劑盒和DAB顯色試劑盒，購自北京中杉生物技術(shù)公司。Rnase A及 proteinase K，購于大連寶生物；SDS、氫醌(Hydroquiinone)和亞硫酸氫鈉(Bisulfite)，購自 Sigma 公司。微流控芯片為中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所自行研制的通用型激光誘導(dǎo)熒光微流控芯片。

1.3 方 法

1.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)方法：將無菌蓋玻片至6孔板中，加入細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵箱24 h后取出，PBS洗3 次，冷丙酮固定15 min；Triton X-100 37℃ 孵育 15 min；嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(1∶50)。用 PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3.2 DNA甲基化方法：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)提取 DNA。參見分子克隆。

DNA 亞硫酸氫鈉修飾：于每份 DNA 溶液(1～2 μg/50 μL)中加入 5.5 μL 2 mol/L NaOH，37℃水浴，堿變性 10 min；加入 30 μL 0.2 mol/L 氫醌和 520 μL 3 mol/L 亞硫酸鈉，50℃水浴16～20 h；將堿基轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的 DNA 溶液移至 Wizard column 管中，12 000 r/min 離心1 min；加入 80% 異丙醇，12 000 r/min 離心 1 min；將 Wizard column 置于另一 Eppendorf 管中，用 50 μL ddH2O 洗脫 DNA；于洗脫液中加入5.5 μL 3 mol/L NaOH，5 min 后加入 120 μL 95% 乙醇，66 μL 5 mol/L 醋酸銨，3 μL 糖原，室溫 60 min，12 000 r/min 4℃ 離心 25 min。

改良半巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)：采用兩對(duì)引物分別對(duì)已完成化學(xué)修飾的樣本 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。E-cadherin甲基化(M 116 bp)上游引物：taa cta aaa att cac cta ccg ac，下游引物：tta ggt tag agg gtt atc gcg t；非甲基化(U 97 bp)上游引物：cac aac caa tca ava aca ca，下游引物：taa ttt tag gtt aga ggg tta ttg t(引物由大連寶生物合成)。將5 μL 處理后 DNA 加入 200 mmol/L dNTPs、25 mmol/L 引物，2 U Taq 聚合酶，行 PCR 反應(yīng)；將 PCR 產(chǎn)物稀釋 10 倍后，取 1 μL稀釋液加入相同的 PCR 試劑中，進(jìn)行第二次 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：95℃，預(yù)變性 10 min，[95℃，變性30 s；52℃(非甲基化)或 50℃(甲基化)，退火 30 s；72℃，延伸 30 s；29 個(gè)循環(huán)]，72℃，延伸 10 min；4℃ 保存。取 15 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 2% 瓊脂糖凝膠中電泳。

結(jié)果判斷：同時(shí)滿足以下條件時(shí)判斷為結(jié)果有效：以雙蒸水作空白對(duì)照經(jīng)甲基化引物擴(kuò)增不出現(xiàn)相應(yīng)條帶，同時(shí)甲基化引物或非甲基化引物必須擴(kuò)增出任何一條產(chǎn)物帶，或者兩種引物均擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物帶。若僅非甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段為甲基化陰性，僅甲基化引物擴(kuò)增出相應(yīng)片段為完全甲基化，甲基化引物和非甲基化引物均擴(kuò)增出相應(yīng)片段為不完全甲基化。完全甲基化和不完全甲基化均計(jì)為甲基化檢測陽性[3]。

微流控芯片甲基化檢測：分離電壓 150～250 V/cm，抑制電壓 340～400 V/cm，進(jìn)樣電壓 400 V/cm；將樣品(5 μL PCR 產(chǎn)物及 5 μL marker) 加入樣品池中，盡量保持各池中液面高度一致。芯片為一次性使用。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌細(xì)胞株中 E-cadherin 蛋白的表達(dá)

NCI-H460、SPCA 和 A549 細(xì)胞的胞漿內(nèi)見淡黃色或黃色顆粒，其中SPCA 中表達(dá)較強(qiáng)，A549 中表達(dá)最弱(圖1)。NCI-H460、SPCA 和 A549 細(xì)胞以及陰性對(duì)照 SPCA 細(xì)胞中 E-cadherin 蛋白表達(dá)的平均灰度掃描結(jié)果分別為：0.09±0.018、0.11±0.024、0.05±0.020和0.02±0.010。

圖1 E-cadherin在肺癌細(xì)胞株中的表達(dá) (SP法 ×400)

2.2 MSP 法 E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化的檢測結(jié)果

NCI-H460、SPCA 和 A549 細(xì)胞株中均可見明顯的E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化引物的產(chǎn)物帶(圖2)，其中 NCI-H460 中還可見明顯的非甲基化的產(chǎn)物帶，SPCA 中見一弱的非甲基化的產(chǎn)物帶，A549 中的非甲基化的產(chǎn)物帶更弱(圖2)。

2.3 微流控芯片檢測E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化的結(jié)果

NCI-H460、SPCA 和 A549 細(xì)胞株中分別經(jīng)甲基化引物擴(kuò)增后的 DNA 經(jīng)過微流控芯片后均可見明顯的波峰，NCI-H460 和 SPCA 中非甲基化引物可見低的波峰，A549 細(xì)胞株中無非甲基化波峰。其中 NCI-H460 細(xì)胞株甲基化和非甲基化產(chǎn)物的微流控芯片檢測結(jié)果見圖3。

圖2 肺癌細(xì)胞中E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化檢測

圖3 NCI-H460 細(xì)胞中E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化檢測結(jié)果

3 討 論

近年來，陸續(xù)報(bào)道了一系列重要的腫瘤相關(guān)基因，如鈣粘素、層粘連蛋白等。但這些基因在腫瘤中發(fā)生改變的機(jī)制尚不明了，盡管它們在腫瘤中的表達(dá)普遍下調(diào)，但其遺傳改變的發(fā)生率卻極低。目前認(rèn)為表觀遺傳學(xué)的改變，如 DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)區(qū)室的嚴(yán)重紊亂是人腫瘤的共同特點(diǎn)[4]，尤其是 CpG 島超甲基化引起相關(guān)基因沉默，有可能解釋眾多基因的異常表達(dá)[5]。E-cadherin 是鈣粘附蛋白家族中經(jīng)典亞族成員，是維持正常上皮完整性和極性的跨膜糖蛋白，其表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)是上皮細(xì)胞離散的分子基礎(chǔ)[6]。近年來研究表明 E-cadherin 具有腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移抑制功能，被認(rèn)為是腫瘤侵襲抑制因子[1]。在對(duì)腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)抑癌基因的失活通常是由于基因突變、缺失、異常甲基化所致[7,8]。E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域 CpG 島高度甲基化可能改變?nèi)旧w局部構(gòu)象，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)啟動(dòng)子結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄過程。

本研究在對(duì)肺癌組織和癌旁肺組織中 E-cadherin 蛋白表達(dá)的檢測中發(fā)現(xiàn)，該蛋白在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)，盡管在肺癌組織和配對(duì)的癌旁肺組織中均有E-cadherin基因染色體的點(diǎn)突變發(fā)生，但二者的突變率沒有明顯差異，可能基因突變不是引起E-cadherin 蛋白下調(diào)的唯一因素(另文發(fā)表)。為探討肺癌中 E-cadherin 蛋白異常改變的機(jī)制，作者在 NCI-H460、SPCA 和 A549 細(xì)胞株中檢測到E-cadherin蛋白均下調(diào)，提示E-cadherin 蛋白在肺癌細(xì)胞株中呈低表達(dá)，此三種細(xì)胞可以作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其中尤?A549 細(xì)胞中下調(diào)的更為明顯。通過半巢式甲基化特異性 PCR 法(MSP)在三種細(xì)胞中均檢測到了E-cadherin基因啟動(dòng)子的高甲基化改變，表明在三種肺癌細(xì)胞株中均有E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生；在細(xì)胞中出現(xiàn)非甲基化產(chǎn)物帶分析是由于細(xì)胞的 DNA 甲基轉(zhuǎn)化不完全所致，A549 細(xì)胞中E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化最完全。用敏感性更高的微流控芯片技術(shù)[9]對(duì)三種細(xì)胞的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)一步檢測的結(jié)果與 MSP 法檢測的結(jié)果一致性很高，表明三種肺癌細(xì)胞株均發(fā)生了E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化，在 A549 細(xì)胞中E-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化程度最高，這一結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測三種細(xì)胞中 A549 細(xì)胞的E-cadherin 蛋白表達(dá)最低相一致，分析其原因是由于在A549 細(xì)胞中E-cadherin基因啟動(dòng)子充分發(fā)生了甲基化所致。結(jié)果提示，E-cadherin基因啟動(dòng)子高度甲基化可能是 E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)的主要原因。

CpG 島的異常甲基化是腫瘤中的普通現(xiàn)象，而且這些甲基化改變通常發(fā)生于細(xì)胞惡變之前，因此甲基化可能成為腫瘤早期診斷的標(biāo)記物。臨床血漿檢測是一種微創(chuàng)的的檢測方法，作者已經(jīng)應(yīng)用微流控芯片技術(shù)在血漿中進(jìn)行了p16基因異常甲基化的檢測[9]，建立了應(yīng)用微流控芯片技術(shù)檢測基因甲基化改變的平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示E-cadherin基因啟動(dòng)子高度甲基化與 E-cadherin 功能異常有關(guān)。王紅兵等[10]在對(duì)肺癌組織與癌旁肺組織和正常肺組織的研究中認(rèn)為肺癌組織中存在E-cadherin基因啟動(dòng)子的異常甲基化，王洪濤等[11]報(bào)道E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的 CpG 島異常高度甲基化引起 E-cadherin 蛋白表達(dá)的下調(diào)，這些報(bào)道均提示E-cadherin基因啟動(dòng)子高度甲基化與 E-cadherin 功能異常密切相關(guān)。Saito K等[12]認(rèn)為CDH13 和RASSF1甲基化是 IA 期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的獨(dú)立標(biāo)記。因此作者認(rèn)為，E-cadherin基因啟動(dòng)子高度甲基化也有可能成為早期診斷的標(biāo)記，如果在臨床肺癌患者血漿中也能檢測到這種異常甲基化改變，將在臨床中有很大的應(yīng)用價(jià)值，相關(guān)研究將繼續(xù)進(jìn)行。

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