李新社，陸步詩(shī)，鄧孟橋，殷 桃，胡墩柱

(邵陽(yáng)學(xué)院 生物與化學(xué)工程系，湖南 邵陽(yáng)，422000)

能源是經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重要?jiǎng)恿?。面?duì)全球社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，人類(lèi)對(duì)能源的需求日益增長(zhǎng)，僅中國(guó)能源消耗每年就以超過(guò) 10%的速度增長(zhǎng)[1]。隨著能源需求的日益增長(zhǎng)，石油儲(chǔ)量的日益減少、資源逐漸枯竭，全世界正面臨著能源短缺的危機(jī)，開(kāi)發(fā)替代燃料及可再生能源——生物柴油已迫在眉睫。所謂生物柴油是指以植物油、動(dòng)物脂肪等可再生資源生產(chǎn)的可用于壓燃式發(fā)動(dòng)機(jī)的清潔替代燃油[2]，其突出的環(huán)保性和可再生性，引起了世界各國(guó)尤其是資源貧乏國(guó)家的高度重視。目前，生物柴油多是利用動(dòng)、植物脂肪及餐飲廢油為原料制成，受原料成本及收集、運(yùn)輸?shù)挠绊?，?jīng)濟(jì)可行性差。微生物油脂又稱(chēng)單細(xì)胞油脂(SCO)，是酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類(lèi)等微生物在一定條件下以碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭鳛樘荚?，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂，可以轉(zhuǎn)化成生物柴油。開(kāi)發(fā)微生物油脂具有發(fā)酵周期短，不受場(chǎng)地、季節(jié)和氣候影響的特點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，微生物油脂發(fā)酵是生物柴油產(chǎn)業(yè)和生物經(jīng)濟(jì)的重要研究方向。對(duì)于微生物油脂發(fā)酵生產(chǎn)研究起步較早，國(guó)外主要集中在獲取附加值較高的功能性油脂上[4-7]，國(guó)內(nèi)在 20世紀(jì) 60年代就有生產(chǎn)微生物油脂的報(bào)道。高產(chǎn)油脂突變菌株的選育起始于20世紀(jì)90年代，目前，研究和應(yīng)用較多的主要是深黃被孢霉、斯達(dá)氏酵母、紅酵母以及假絲酵母等[8-13]。利用皮狀絲孢酵母生產(chǎn)微生物油脂的研究很少。為此，本文作者以皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum)GIM 2.68為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變，以篩選出高產(chǎn)油脂突變菌株，以便為發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂提供新的生產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料為：皮狀絲孢酵母(Trichosporon cutaneum，GIM2.68)菌種，由廣東微生物研究所菌種保藏中心提供；麥芽，由湖南省邵陽(yáng)市百惠啤酒廠提供。

儀器為：紫外線分光光度計(jì)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、超凈工作臺(tái)、立式高壓蒸汽滅菌鍋、振蕩式精密恒溫水浴槽、離心機(jī)、顯微鏡、電子分析天平、紫外燈、磁力攪拌器、血球計(jì)數(shù)板等。

試劑為：蔗糖、瓊脂、蘇丹黑、二甲苯、沙黃，為市售化學(xué)純商品；鹽酸、氯仿、甲醇等，為市售分析純商品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

(1) 麥芽汁培養(yǎng)基(菌種活化與培養(yǎng)用)配制：取1 kg大麥芽，加55～60 ℃溫水 4 kg左右，在55～60 ℃水浴鍋中保溫糖化 3～4 h，至液體中加碘無(wú)淀粉反應(yīng)為止。先用紗布過(guò)濾，煮沸20 min后分別用定性和定量濾紙各過(guò)濾 1次，調(diào)節(jié)糖度至 10°Be′(含糖量約18 g/(100 mL))，固體培養(yǎng)基的瓊脂添加量為 1.5%～2.0%，分裝后加棉塞并包扎好，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[14]。

(2) 麩皮斜面培養(yǎng)基(菌種保藏用)配制：麩皮30 g，加300 mL水，煮沸30 min，過(guò)濾，濾液加入3 g蔗糖及適量無(wú)機(jī)鹽混合液，加入2%瓊脂，熔化定容至300 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2 菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下取少量菌種接種至麥芽汁斜面培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，獲得活化菌種。將菌種活化2～3次。將已活化的斜面培養(yǎng)基上的菌種刮落到定量無(wú)菌水中，充分搖勻后移取一定量菌液至新鮮的麥芽汁液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃下恒溫振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)2 d。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的繪制

取25支20 mL試管，分別裝等量(10.0 mL)同種麥芽汁液體培養(yǎng)基滅菌備用。用移液管向每只試管中移取經(jīng)過(guò)充分搖勻的皮狀絲孢酵母擴(kuò)大培養(yǎng)液 0.5 mL，放入搖床發(fā)酵培養(yǎng)箱中于28 ℃恒溫培養(yǎng)。每2 h從培養(yǎng)箱中取出1支試管并且編號(hào)放入冰箱冷藏。待所有試管全部拿出時(shí)，在波長(zhǎng)600 nm下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)并記錄吸光度。

1.2.4 生物量的檢測(cè)

將定量培養(yǎng)液置于離心管中在轉(zhuǎn)速4 500 r/min下離心10 min，除去上清液，收集下面固形物于三角瓶中干燥(干燥溫度為80 ℃)至質(zhì)量恒定，用電子分析天平稱(chēng)取干菌體質(zhì)量，計(jì)算生物量。每個(gè)樣品做平行試驗(yàn)3次。

1.2.5 油脂質(zhì)量的檢測(cè)

將培養(yǎng)液用凍融法(在-30 ℃與37 ℃反復(fù)凍融3次，再進(jìn)行超聲破碎) 使細(xì)胞破裂，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心15 min取上清液，分別添加適量(約40 mL)鹽酸水解，于室溫下靜置20 min，用沸水浴加熱10 min，加入適量(約50 mL)氯仿與甲醇(體積比為1∶1)的混合液，振蕩30 min，置于1 000 mL分液漏斗中分液，取氯仿層，真空干燥除去氯仿即得油脂，稱(chēng)取油脂質(zhì)量[15]，并計(jì)算油脂得率η。每個(gè)樣品做平行試驗(yàn)3次。

η＝[m(粗油脂)/m(干菌體)]×100%

1.2.6 紫外線誘變

將皮狀絲孢酵母活化種移入麥芽汁液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用玻璃珠振蕩10～15 min，使細(xì)胞充分分散，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為108個(gè)/mL。打開(kāi)紫外燈(25 W)預(yù)熱20 min，在直徑為6 cm的無(wú)菌平皿中注入10 mL菌液，在磁力攪拌器作用下于紫外燈下(功率25 W，照射距離36 cm)分別照射10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110和120 s，暗箱保藏2～3 h，在紅燈下分別稀釋10倍和100倍后各取0.10 mL菌液進(jìn)行平板涂布，在28℃恒溫培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計(jì)平板上菌落個(gè)數(shù)。以未經(jīng)照射的菌液為對(duì)照，計(jì)算致死率并繪制紫外線致死曲線[16]。

1.2.7 突變菌株的初篩

吸取在最佳誘變條件下的誘變菌液進(jìn)行 10倍稀釋(10-1，10-2，10-3)后涂布平板，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d，觀察平板上菌落的形態(tài)特征。取菌涂片，用蘇丹黑染色15 min，二甲苯?jīng)_洗，至無(wú)色時(shí)再用沙黃復(fù)染，水洗，吸干后鏡檢。在顯微鏡下菌絲呈紅色，菌體內(nèi)的脂肪顆粒呈藍(lán)黑色[17]。選取顯微鏡下觀察顏色較深的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.8 突變菌株的復(fù)篩

分別選取初篩含脂量較出發(fā)菌株高(顏色較深)的突變菌落適量，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)至相同菌液濃度，分別取2 mL接種至100 mL液體培養(yǎng)基上，在28 ℃下?lián)u床恒溫培養(yǎng)2 d后，檢測(cè)生物量與油脂產(chǎn)量。

1.2.9 菌種的保藏

選取生物量與油脂得率高的菌株移接至麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)多次連續(xù)傳代，選育性能穩(wěn)定的菌株保藏于麩皮斜面培養(yǎng)基上。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母生長(zhǎng)曲線

將皮狀絲孢酵母接種活化后，接種在麥芽汁中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣，在600 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外檢測(cè)并記錄吸光度。皮狀絲孢酵母的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

1)氣象廣域網(wǎng):采用“雙路由器+雙線路”冗余備份模式,使用全省統(tǒng)一的OSPF路由協(xié)議實(shí)現(xiàn)鏈路冗余,任何一條線路故障,均能通過(guò)OSPF自動(dòng)收斂實(shí)現(xiàn)鏈路自動(dòng)切換,保障氣象業(yè)務(wù)的連續(xù)性;配置兩臺(tái)鏈路防火墻用于風(fēng)險(xiǎn)防御和訪問(wèn)控制。

圖1 皮狀絲孢酵母生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Trichosporon cutaneum

由圖1可以看出：皮狀絲孢酵母的1個(gè)生長(zhǎng)周期為36 h，其中從開(kāi)始培養(yǎng)至12 h為適應(yīng)期，12～20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，20～28 h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期。穩(wěn)定期后，由于細(xì)胞繁殖越來(lái)越慢，菌體自溶，死亡數(shù)越來(lái)越多，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期；培養(yǎng)12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明該菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)；衰亡期曲線較平穩(wěn)，表明菌體自溶微弱，在培養(yǎng)過(guò)程中菌體形態(tài)較為單一。由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為生理活性一致的活細(xì)胞，突變率高，重現(xiàn)性好，因此，選取培養(yǎng)14 h后的皮狀絲孢酵母作為誘變出發(fā)菌株。

2.2 皮狀絲孢酵母紫外線致死曲線

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的出發(fā)菌株在 UV下照射不同時(shí)間，通過(guò)平板活菌計(jì)數(shù)法得出照射后活細(xì)胞含量，計(jì)算致死率。皮狀絲孢酵母的紫外線致死曲線見(jiàn)圖2。

圖2 皮狀絲孢酵母的紫外線致死曲線Fig.2 UV death curve of Trichosporon cutaneum

由圖2可以看出：照射時(shí)間在20 s以?xún)?nèi)時(shí)，紫外線誘變對(duì)皮狀絲孢酵母影響不大；而大于60 s時(shí)，菌體死亡率為90%以上。由于正突變多發(fā)生在致死率為70%～80%，因此，選用紫外線照射50 s后，菌體的死亡率為70%，作為最佳處理劑量進(jìn)行誘變。

2.3 突變菌株的篩選

2.3.1 突變菌株的初篩

將紫外線照射50 s后的皮狀絲孢酵母菌液在麥芽汁平板上進(jìn)行涂布，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d，觀察平板上菌落的形態(tài)特征并對(duì)平板上長(zhǎng)出的所有菌落取菌涂片，用蘇丹黑染色后在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，將蘇丹黑染色較深的10個(gè)涂片分別用Tc1，Tc2，Tc3，…，Tc10標(biāo)記，其顯微鏡檢像見(jiàn)圖3。

由圖3可以看出：選出的10個(gè)菌株蘇丹黑染色顏色明顯較出發(fā)菌株的深，表明這10個(gè)菌株細(xì)胞的脂肪含量高于出發(fā)菌株含量。在10個(gè)蘇丹黑染色顏色較深的菌株中，相對(duì)較深的是Tc1，Tc3，Tc5，Tc6和Tc10菌株，因此，選取這5個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

2.3.2 突變菌株的復(fù)篩

圖3 蘇丹黑染色鏡檢像Fig.3 Microscope images with Sudan black staining

表1 突變菌株生物量與油脂產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果Table1 Test results of mutant biomass and oil production

由表1可知：Tc3菌株油脂的產(chǎn)量最高，為0.374 8 g/(100 mL)；Tc1菌株油脂的產(chǎn)量次之，為 0.261 9 g/(100 mL)；Tc3菌株的生物量為1.047 0 g/(100 mL)，Tc1菌株的生物量為0.854 1 g/(100 mL)；Tc3菌株油脂得率為35.8%，Tc1菌株油脂得率為30.6%。研究結(jié)果顯示：生物量、油脂產(chǎn)量與油脂得率之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，表明細(xì)胞內(nèi)油脂是在菌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中積累的。細(xì)胞生長(zhǎng)速度越快，單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，生物量越大，則積累油脂越多。對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度越快，生產(chǎn)周期越短，越有利于提高生產(chǎn)效率，降低產(chǎn)品成本。因此，確定Tc3菌株為高產(chǎn)油脂突變菌株。

2.4 Tc3菌株與出發(fā)菌株比較

將Tc3菌株與出發(fā)菌株以相同的接種量接種到麥芽汁培養(yǎng)基中，在28 ℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 d后，檢測(cè)生物量與油脂產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Tc3菌株和出發(fā)菌株的生物量與油脂產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果Table2 Test results of biomass and oil production of Tc3 strain and original strain

由表2可知：與出發(fā)菌株相比，Tc3菌株生物量提高 38.81%，油脂產(chǎn)量提高 86.10%，油脂得率提高34.09%。

2.5 Tc3菌株的傳代與保藏

2.5.1 Tc3菌株的傳代

將篩選到的 Tc3菌株接種到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d(共活化3次)，移接至麥芽汁液體培養(yǎng)基中(三角瓶)，于28 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)2 d后測(cè)試生物量與產(chǎn)脂性能，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Tc3菌株生物量與油脂產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果Table3 Test results of biomass and oil production of Tc3 strain

由表3可知：經(jīng)多次傳代后，Tc3菌株的生物量為1.046 9 g/(100 mL)，油脂產(chǎn)量為0.372 5 g/(100 mL)，油脂得率為 35.6%，與傳代前相比，生物量與產(chǎn)脂性能基本穩(wěn)定。結(jié)果表明：利用誘變獲得的高產(chǎn)油脂突變菌株作為油脂發(fā)酵生產(chǎn)用菌株，具有一定的應(yīng)用性。如果對(duì)該突變株的培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究并進(jìn)一步在發(fā)酵罐水平上對(duì)油脂的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究最適發(fā)酵動(dòng)力學(xué)條件(溫度、時(shí)間、pH、溶氧量、攪拌速度、接種量、培養(yǎng)基)，油脂產(chǎn)量有望進(jìn)一步提高。

2.5.2 突變菌株的保藏

將經(jīng)過(guò)多次傳代后生物量與產(chǎn)脂性能穩(wěn)定的突變菌株移接到麩皮斜面培養(yǎng)基上，在 28 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d后，置于溫度為4 ℃的冰箱中保藏。

3 結(jié)論

(1) 皮狀絲孢酵母的生長(zhǎng)周期為 36 h，從開(kāi)始培養(yǎng)至12 h為適應(yīng)期，培養(yǎng)12～20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)20～28 h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期。

(2) 利用25 W紫外燈，在照射距離為36 cm條件下，照射50 s，可以篩選到生物量為1.047 g/(100 mL)，油脂產(chǎn)量為0.374 8 g/(100 mL)，油脂得率為35.8%的突變菌株 Tc3。與出發(fā)菌株相比，生物量提高了38.81%，油脂產(chǎn)量提高了 86.10%，油脂得率提高了34.09%。結(jié)果表明：誘變篩選方法是有效的，利用突變菌株生產(chǎn)微生物油脂具有一定的可行性。

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