弓 超,王凌云,周歡敏

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院,內蒙古呼和浩特 010018)

牛乳腺上皮細胞體外分離和培養(yǎng)*

弓 超,王凌云,周歡敏*

(內蒙古農業(yè)大學生命科學學院,內蒙古呼和浩特 010018)

從健康奶牛乳房無菌采取乳腺組織,通過添加兩種不同的培養(yǎng)液來分離、培養(yǎng)、純化牛乳腺上皮細胞,研究乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)效果。結果表明,使用組織塊接種可以得到大量細胞用于體外培養(yǎng)。在以DMEM/F12為基礎的普通培養(yǎng)液中進行乳腺上皮細胞體外培養(yǎng),原代細胞生長較慢,細胞形態(tài)不典型。而添加表皮生長因子、胰島素、氫化可的松所組成的完全培養(yǎng)液中,奶牛乳腺上皮細胞生長良好。并通過細胞形態(tài)學觀察,細胞染色體核型分析,熒光免疫細胞染色方法鑒定了培養(yǎng)的細胞表達上皮細胞特異的角蛋白K14,K15。結果表明,分離培養(yǎng)的細胞是牛乳腺上皮細胞。

乳腺上皮細胞;體外培養(yǎng);奶牛

動物乳腺生物反應器是伴隨動物轉基因技術而發(fā)展起來的一項高新生物技術。利用這項技術可以從動物乳汁中源源不斷地獲取用于醫(yī)療或保健目的的有生物活性的基因表達產物。使用乳腺上皮細胞來檢測乳腺特異性表達載體的功能,這一方法具有快捷、方便且能夠真實反映乳腺表達載體在生物體內表達水平等優(yōu)點[1]。牛乳腺上皮細胞系的成功構建,為后續(xù)轉基因動物生產的研究及檢測目的基因的表達情況打下了基礎。

牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)已有半個多世紀的歷史,但目前已建立的牛乳腺細胞系并不多。1957年,Boddy M N等[2]首先利用膠原酶消化的方法將乳腺細胞或乳腺細胞團(含上皮細胞較多)從乳腺組織中分離出來,第1次實現(xiàn)了乳腺細胞的直接培養(yǎng)。由于乳腺上皮細胞是一種高度分化的細胞,必須不斷地摸索體外培養(yǎng)的最佳條件及添加因子的作用,同時乳腺細胞在培養(yǎng)過程中容易脫離分化,必須培養(yǎng)在適宜條件下,才可維持其分化狀態(tài)[3]。到目前為止建立的有限的永生化細胞系難度大,種類少,最早建立的幾個乳腺上皮細胞系,有的甚至都發(fā)生了細胞特性的轉移[4]。因此,建立乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)方法,了解體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)特征和生物學特性,對進一步了解泌乳的調控機理以及作為一個檢測系統(tǒng)驗證乳腺表達載體的功能都具有重要意義[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體材料 牛乳腺組織取自呼和浩特市北亞清真屠宰公司。

1.1.2 主要儀器設備 超凈工作臺(鄭州南北儀器設備有限公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo),倒置顯微鏡(Nikon),水浴鍋(memmer,德國),超純水機(pall,美國),高壓滅菌鍋(HIRAYAMA),超低溫冰箱(Thermo),液氮罐(樂山市東亞機電工貿有限公司),低速臺式離心機(Anke),細胞計數板(上海求精生化試劑儀器有限公司)。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12溶液為Hyclone產品;DMSO、胰蛋白酶(T rypsin)、各種無機鹽類為Sigma產品,標準胎牛血清為 TBD產品,表皮生長因子(EGF)、胰島素、氫化可的松(Sigma),多聚甲醛、醫(yī)用酒精等為國產試劑。

1.1.4 主要溶液配制 1.乳腺上皮細胞培養(yǎng)液:A:DMEM/F12+15%FBS+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素。B:DMEM/F12+15%FBS+10 ng/mL EGF+10 μ g/mL 氫化可的松 +5 μ g/mL胰島素 +100單位/mL青霉素 +100單位/mL鏈霉素。2.細胞冷凍液:70%DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO新鮮配制。34 g/L多聚甲醛固定液:10 mLPBS溶解0.4 g多聚甲醛,磁力攪拌。用NaOH調pH到7.2,需先加入NaOH邊加熱邊振蕩,加熱溫度控制于60℃以下。

1.2 方法

1.2.1 組織塊法分離培養(yǎng)牛乳腺上皮細胞 從屠宰場取新鮮的泌乳期的牛乳腺組織,生理鹽水沖洗干凈,直至沒有乳汁和血液,并置于預先加有100單位/mL青霉素、100單位/mL鏈霉素的PBS中迅速帶回實驗室。剝離導管組織,去除脂肪及結締組織,用 PBS反復沖洗 3遍,剪去導管兩端,并用750 mL/L的酒精處理30 s。在含有微量培養(yǎng)液的青霉素小瓶中,將導管組織盡可能的剪碎;用牙科探針將小組織塊接種到培養(yǎng)皿上,不加培養(yǎng)液,置于37℃、體積分數為5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁4 h左右。然后加適量培養(yǎng)液,放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞傳代培養(yǎng)及乳腺上皮細胞的純化 待細胞基本長滿培養(yǎng)板底壁,吸去原有培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞兩次,加入 2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA 37℃培養(yǎng)箱消化,不斷在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),待大多數細胞回縮,變圓,細胞間隙擴大時,終止消化,反復吹打細胞,1 500 r/min離心5 min,利用成纖維細胞與上皮細胞貼壁時間的差異性,將貼壁時間較長的上皮細胞連同培養(yǎng)液一起轉移到新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),反復操作3次左右,就會得到較為純化的乳腺上皮細胞。

1.2.3 牛乳腺上皮細胞凍存和復蘇培養(yǎng) 將消化后的細胞加入 1 mL新鮮的無血清培養(yǎng)液重懸細胞,血球計數板計數后,用細胞冷凍液調整細胞至5×106個/mL,每個凍存管分裝1 mL,放入凍存盒,于-80℃冰箱過夜,然后投入液氮中長期保存。當細胞解凍復蘇時,從液氮罐中取出凍存管,迅速投入37℃的水浴鍋中,快速晃動,使其完全融化。用5 mL預熱的培養(yǎng)液重懸細胞,1 500 r/min,離心5 min棄上清,收集細胞,加入3 mL生長培養(yǎng)液重懸細胞,將其接種于直徑為 60 mm的培養(yǎng)皿中,于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

1.2.4 乳腺上皮細胞生長曲線的繪制 培養(yǎng)至第5代的乳腺上皮細胞生長至80%～90%匯合時,消化離心,收集細胞,以6×103個/mL的密度接種于24孔板中,每孔加入 1 mL培養(yǎng)液,于 37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。每天同一時間用2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA消化3孔細胞,進行細胞計數,然后取平均值。連續(xù)進行8 d。計數期間每隔3 d換一次培養(yǎng)液。以培養(yǎng)的時間為橫坐標,每天所計3孔細胞的平均值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5 乳腺上皮細胞染色體分析

(1)待上皮細胞生長至80%匯合時,加入秋水仙素(終濃度為0.2 μ g/mL),37 ℃培養(yǎng)4 h;

(2)棄掉培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化10 min,終止消化,1 500 r/min,離心5 min棄上清,收集細胞;

(3)緩慢加入37℃預熱的0.075 mol/L KCl,37℃低滲處理30 min;

(4)低滲后加入10 mL固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1),預固定5 min;

(5)1 500 r/min,離心 5 min,棄上清,留約500 μ L,輕振懸浮細胞 ;

(6)加10 mL固定液,第1 mL逐滴加,混勻,室溫固定20 min;

(7)重復步驟5;(8)重復步驟6;(9)1 200 r/min,離心5 min,棄上清 ,加 1.5 mL固定液,輕振懸浮細胞;

(10)吸取少量細胞懸液,滴落在預冷的干凈的載玻片上,迅速在酒精燈火焰上烘烤;

(11)制備好的染色體滴片用Giemsa染色液浸染15 min,流水沖洗干凈。自然干燥后,在顯微鏡下觀察,統(tǒng)計染色體數目。

1.2.6 熒光免疫細胞染色法鑒定乳腺上皮細胞用熒光免疫染色法檢測培養(yǎng)的乳腺上皮細胞中特有蛋白的表達情況,同時用牛成纖維細胞作為陰性對照組:

(1)將生長正常的乳腺上皮細胞,在室溫下,用40 mL/L多聚甲醛固定生長于 24孔板中的細胞30 min,之后PBS清洗3次,每次5 min;

(2)加入 0.3%的 Triton X-100通透處理5 min,PBS清洗3次,每次5 min;(3)加入100 mL/L正常山羊血清的PBS封閉液處理30 min;

(4)加小鼠抗人的細胞角蛋白K14和K15單克隆抗體(1∶100稀釋)于室溫下振蕩孵育1 h;

(5)加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG的二抗(1∶50稀釋),室溫下避光振蕩孵育30 min,PBS清洗3次,每次5 min;

(6)加入含碘化丙錠(propidium iodide,PI)10 μ g/mL 的PB,室溫下染核10 min,用熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果

2.1 兩種培養(yǎng)液對乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)的影響

用普通DMEM/F12培養(yǎng)液和添加因子的完全培養(yǎng)液均能夠獲得乳腺上皮細胞。但是兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的原代細胞析出時間及細胞形態(tài)不同。普通DMEM/F12培養(yǎng)液經原代培養(yǎng)10 d左右才會有細胞析出(圖1),而添加因子的完全培養(yǎng)液一般在7 d左右就會有細胞析出(圖2)。兩種方法長出的都是乳腺上皮細胞與成纖維細胞的混合體,成纖維細胞多成條狀、旋渦狀或放射狀排列,而上皮細胞則多呈短的梭形或多角形,細胞之間緊密相靠,相互銜接,連接成片(圖3)。但是添加因子的完全培養(yǎng)液得到的乳腺上皮細胞形態(tài)更為典型(圖2)。

圖1 普通DMEM/F12培養(yǎng)液原代培養(yǎng)10 d(100×)Fig.1 The bovine mammary epithelial cells cultured with DMEM/F12 for 10 d(100×)

圖2 添加因子的完全培養(yǎng)液原代培養(yǎng)10 d(100×) Fig.2 The bovine mammary epithelial cells cultured with complete g rowth medium for 10 d(100×)

圖3 原代培養(yǎng)中上皮細胞與成纖維細胞混雜生長的狀態(tài)(100×)Fig.3 T he bovine mammary epithelial cells primarily cultured(100×)

2.2 乳腺上皮細胞與成纖維細胞的分離純化培養(yǎng)

成纖維細胞與上皮細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,在消化培養(yǎng)時,常是成纖維細胞先脫壁,而上皮細胞要消化相當長時間才脫壁;而且成纖維細胞與上皮細胞相比,其貼壁過程快,大部分細胞常能在短時間內(大約10 min～30 min)完成附著過程(但不一定完全伸展),而上皮細胞大部分在短時間內不能附著或附著不穩(wěn)定,稍加震蕩即浮起。綜合這兩個特性進行純化,在1 h貼壁培養(yǎng)的孔中,長的基本都是成纖維細胞,隨后的孔中成纖維細胞逐漸變少。用這種方法一般經過2次～3次的選擇傳代即可得到純化的乳腺上皮細胞系(圖4)。

2.3 乳腺上皮細胞的解凍復蘇培養(yǎng)

凍存的牛乳腺上皮細胞經解凍接種培養(yǎng)皿后,保持著細胞聚集生長的上皮細胞的典型特征。細胞培養(yǎng)過程中,細胞形態(tài)良好。由此證明常規(guī)的細胞冷凍保存及解凍復蘇的培養(yǎng)方法適用于牛乳腺上皮細胞(圖5)。

2.4 乳腺上皮細胞生長曲線的繪制

以細胞培養(yǎng)天數為橫坐標,平均細胞數為縱坐標繪制了牛乳腺上皮細胞生長曲線圖(圖6)。細胞生長曲線基本呈現(xiàn)典型的“S”形,符合細胞生長的一般生物學規(guī)律。生長曲線顯示:牛乳腺上皮細胞生長潛伏期為0 d～2 d,對數生長期為2 d～6 d,6 d后進入平臺期。試驗結果表明,培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞具有正常細胞的分裂增殖特征。

2.5 乳腺上皮細胞染色體分析

觀察結果:細胞核型穩(wěn)定,在離體培養(yǎng)條件下不發(fā)生轉化。選擇分散良好和輪廓清晰的30個分裂相進行統(tǒng)計分析,結果表明28個分裂相具有正常的染色體數目(2n=60),正常率93.3%(28/30)。圖7為其中的1個分裂相。

2.6 熒光免疫細胞染色分析細胞角蛋白K14、K15的表達

應用熒光免疫細胞染色分析了分離培養(yǎng)并經過純化后的乳腺上皮細胞的骨架蛋白——角蛋白14、15表達情況,分析結果表明:分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞幾乎全部呈陽性(圖8～圖11)。這一結果證明了分離培養(yǎng)的細胞是乳腺上皮來源且具有乳腺上皮細胞的正常生理功能,牛成纖維細胞作為陰性對照,成纖維細胞胞質無顯色。

圖4 乳腺上皮細胞純化(100×)Fig.4 The bovine mammary epithelial cells purified(100×)

圖5 解凍后的乳腺上皮細胞(100×)Fig.5 The bovine mammary epithelial cells cultured after thawing(100×)

圖6 牛乳腺上皮細胞生長曲線 Fig.6 The growth curve of the bovine mammary epithelial cells

圖7 牛乳腺上皮細胞的染色體(2n=60)Fig.7 Chromosome of the bovine mammary epithelial cells(2n=60)

圖8 純化的乳腺上皮細胞K15抗體染色(20×)Fig.8.The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K15(20×)

圖9 暗場條件下純化的乳腺上皮細胞K15抗體染色(20×)Fig.9 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K15 in dark field(20×)

圖 10 純化的乳腺上皮細胞K14抗體染色(20×)Fig.10 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K14(20×)

圖11 暗場條件下純化的乳腺上皮細胞K14抗體染色(20×)Fig.11 The purified bovine mammary epithelial cells stained with the antibodies K14 in dark field(20×)

圖12 牛成纖維細胞作為陰性對照(20×)Fig.12 Negative control,the bovine fibroblasts stained with the antibodies×20

3 討論

3.1 牛乳腺細胞的原代培養(yǎng)

乳腺是轉基因動物技術的一個主要研究對象,因為通過遺傳操作可改變乳汁成份,獲得具有生物活性成分的重要外源產物[6]。但通過乳腺生物反應器生產能達到商品化生產所需的為數不多。鑒于此,本研究建立了正常牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系,為進一步研究BMEC的增殖和分化以及基因表達調控的分子機制提供了合適的細胞平臺。

動物細胞原代培養(yǎng)主要有兩種方法,即一是組織塊培養(yǎng)法,從貼壁的組織塊周圍可長出細胞單層,這種方法已被證明適用于牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)[7];二是用酶消化法收集單細胞懸液,以密度梯度離心法純化細胞。一些研究表明用酶消化法進行牛乳腺細胞原代培養(yǎng)[8]時,容易損害細胞,特別是對上皮細胞損傷更大。

乳腺是由乳腺組織、結締組織和脂肪組織組成的,而乳腺組織是由導管和腺泡組成的。取材過程中一定要注意避免誤取結締組織和脂肪組織等非乳腺組織,從而可以避免培養(yǎng)過程中雜細胞的污染。本研究用組織塊培養(yǎng)法進行牛乳腺上皮的原代培養(yǎng),選取導管作為組織塊的來源,可以盡量避免組織污染[9]。雖然上皮細胞從組織塊中遷出的速度較慢,所需時間較長,但生長的細胞比較整齊,不易丟失損傷細胞,而且操作方法簡單。原代培養(yǎng)1周左右,組織塊周圍游離出幾個至十幾個細胞生長在一塊,細胞為鵝卵石狀,呈典型的上皮細胞特征。未純化的原代培養(yǎng)物為乳腺上皮細胞和成纖維細胞的混合物。

對于細胞系的純化,本試驗綜合了兩種細胞純化方法:一種為酶消化法,即根據上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同,在消化培養(yǎng)時,常是成纖維細胞先脫壁,而上皮細胞要消化相當長時間才脫壁,特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯,因此利用這種差異采用多次消化法將上皮細胞和成纖維細胞分開;另一種方法是反復貼壁法,因為成纖維細胞能在很短時間內貼壁,而上皮細胞貼壁的時間則較長。綜合這兩種純化方法能夠更快速、更準確的獲得純化的牛乳腺上皮細胞系。

圖 13牛成纖維細胞作為陰性對照(20×)Fig.13 Negative control,the bovine fibroblasts stained with the antibodies in dark field×20

對于乳腺上皮細胞系的凍存,采用與其他類型的細胞相同的細胞凍存液也得到了較好的效果,細胞復蘇后活力較好。而Han Hu等[10]所使用的細胞凍存液是90%FBS加10%DMSO,對于細胞生長特性也沒有改變,這可能與血清對于細胞的生長特性的維持有關。

3.2 不同培養(yǎng)液對乳腺上皮細胞培養(yǎng)的影響

乳腺上皮細胞是高度分化的體細胞,體外培養(yǎng)時,有一定的困難,同時乳腺里含有各種類型的細胞,并且乳腺細胞本身很脆弱,在體外培養(yǎng)經12代左右就明顯衰老[11]。如何得到純度高、活力旺盛的乳腺上皮細胞,合適的培養(yǎng)條件對建立細胞系是十分重要的。特別是培養(yǎng)液和添加因子對細胞生長增殖能力影響更大[12]。本試驗采用兩種培養(yǎng)液進行培養(yǎng),一種為普通培養(yǎng)液(A:DMEM/F12+15%FBS+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素),另一種為添加因子培養(yǎng)液(B:DMEM/F12+15%FBS+10 ng/mL EGF+10 μ g/mL 氫化可的松+5 μ g/mL胰島素+100單位/mL青霉素+100單位/mL鏈霉素)。在原代培養(yǎng)過程中,A培養(yǎng)液可以培養(yǎng)出乳腺細胞,但培養(yǎng)出細胞的時間要大于B培養(yǎng)液培養(yǎng)出細胞的時間。一般用A培養(yǎng)液大概10 d～15 d左右才會有細胞混合生長出現(xiàn)。而選用B培養(yǎng)液,組織塊法大概7 d左右就會有細胞長出。上述結果表明,A培養(yǎng)液與B培養(yǎng)液比較而言,A培養(yǎng)液不適于乳腺上皮細胞的原代及傳代培養(yǎng)。EGF、胰島素、氫化可的松3種因子協(xié)同作用下可以顯著的促進BMEC的增殖。

當培養(yǎng)液中添加胰島素、EGF、氫化可的松時,細胞增殖效果好。胰島素在體外培養(yǎng)中被證實不僅有促進泌乳的作用還有促進DNA合成的作用[13]。Hansen H等[14]證明羊的乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)的情況下也需要胰島素、氫化可的松、催乳素的作用才能分泌β-乳球蛋白和β-酪蛋白,但是綿羊乳腺上皮細胞對氫化可的松的反應不明顯,山羊乳腺上皮細胞乳脂的合成對氫化可的松的反應也不明顯。研究表明[15],EGF雖然其名為表皮生長因子,但它不僅對多種組織來源的上皮細胞都有促增殖活性,而且還對間質細胞的增殖有明顯的促進作用,同時還可以作為腫瘤的促進因子。胰島素是細胞周期的主要外源性調節(jié)因子,和EGF協(xié)同作用可推進細胞周期向前行進,促使細胞由G1后期進入S分裂期。胰島素不僅對于乳蛋白基因的表達是必需的,而且在牛的乳腺組織中在多個時期都會促進和調控乳蛋白的合成[16]。

3.3 乳腺上皮細胞的體外鑒定

體外培養(yǎng)的乳腺細胞鑒定一般是鑒別細胞的標志物,如細胞骨架角蛋白,它是乳腺上皮細胞重要的標志蛋白[17]。本研究中所使用的小鼠抗人的細胞角蛋白K14和K15單克隆抗體對乳腺上皮細胞來源的細胞呈陽性反應,應用此抗體對分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞的免疫組化染色幾乎全部呈強陽性,這一結果證明了分離培養(yǎng)的細胞是乳腺上皮細胞且乳腺上皮細胞的純度很高。

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Study on Culture of Bovine Mammary Epithelial Cellsin Vitro

GONG Chao,WANG Ling-yun,ZHOU Huan-min

(College Of Lif e Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia,010018,China)

In this research,bovine mammary epithelial cells(BMEC)were isolated,purified and culturedin vitro,and further characterized by morphological observation and karyotyping analysis.The tissue-specific expression of cytokeratin K14 and K15 in BMEC was also identified by immunofluorescent cytochemical staining.The results showed that the large number of BMEC could be separated from mammary tissue inoculation.Complete growth medium can cultured BMEC better than DMEM/F12.All these results demonstrated that the purified cells were BMEC.

BMEC;in vitroculture;dairy cow

Q813.11

A

1007-5038(2011)07-0066-06

2010-12-01

內蒙古生物高科技資助項目

弓 超(1984-),男,內蒙古呼和浩特人,碩士研究生,主要從事動物發(fā)育與胚胎工程學研究。*通訊作者