孫希潤 梁大勇 田雪梅 宋愛榮

(山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島農(nóng)業(yè)大學(xué),青島 266109)

樺褐孔菌 (Inonotus obliquus)是一種珍稀、名貴的藥用真菌,是前蘇聯(lián)各共和國、波蘭、日本等國的民間常用藥物,現(xiàn)已從其菌核和菌絲中提取到一種具有明顯降血糖作用的糖蛋白 (FIS-1)和另一種水溶性多糖 (F1)。[1～3]樺褐孔菌的人工栽培研究尚處于初級(jí)階段,重復(fù)性差,距離工業(yè)化或產(chǎn)業(yè)化的路程還十分遙遠(yuǎn)。但其菌絲生長快,液體培養(yǎng)的菌絲產(chǎn)量也較高,可以通過開展深層的發(fā)酵培養(yǎng),從菌絲中提取活性物質(zhì),具有廣闊的前景。本試驗(yàn)研究不同碳源、氮源對(duì)樺褐孔菌F1菌株菌絲生長及多糖含量的影響,以期為菌株的人工馴化栽培及其菌絲多糖的工廠化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

樺褐孔菌F1菌株,由山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保藏。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

①活化母種培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,葡萄糖2%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%,瓊脂2%。②碳源試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:酵母膏 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%。③氮源試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖0.3%,KH2PO40.1%,MgSO4?7H2O 0.05%。

1.3 不同碳源、氮源試驗(yàn)

在碳源試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加含量均為1%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘薯淀粉、玉米淀粉、玉米面(即玉米粉)、乳糖、甘露醇,分別標(biāo)記為C1～C8,以不另添加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照。每種培養(yǎng)基設(shè)5個(gè)重復(fù)。

在氮源試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加各種氮源:0.2%NH4HCO3、 0.2%NaNO3、 0.2%NH4NO3、0.6%豆粉、2.1%麩皮、2.6%玉米面、0.4%蛋白胨、0.2%酵母膏,分別標(biāo)記為N1～N8,以不另添加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照。每種培養(yǎng)基設(shè)5個(gè)重復(fù)。

1.4 液體培養(yǎng)方法

在不同碳、氮源培養(yǎng)基中分別接入10 mL液體菌種,在25℃條件下,150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),每天定瓶取樣,定時(shí)測(cè)定其發(fā)酵液的總糖、還原糖、蛋白質(zhì)的含量及pH值。

1.5 測(cè)定方法

①糖含量的測(cè)定:采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定發(fā)酵液中總糖及還原糖的含量。[4～5]②蛋白質(zhì)含量測(cè)定:采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的含量。③菌絲體測(cè)定:終止發(fā)酵后,觀察菌球大小、顏色、均勻度,觀察發(fā)酵液的顏色、氣味、澄清度及菌球表面分枝情況;將過濾后的菌絲體置于50℃干燥箱中烘至恒重,用上皿電子天平稱重,并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源利用試驗(yàn)的結(jié)果與分析

(1)液體培養(yǎng)條件下菌球干重的測(cè)定。由圖1可以看出,添加葡萄糖的處理C1的菌球干重最大,為2.9199 g/L;添加甘露醇的處理C8次之;其余各處理的干重差別不大;對(duì)照處理菌絲體的干重最小,僅為0.3363 g/L。由此可見,F1菌株在液體培養(yǎng)條件下,碳源是其菌絲生長的基本營養(yǎng)要素之一,其中以葡萄糖為碳源的效果最佳。

圖1 菌絲體碳源利用試驗(yàn)中的菌球干重

(2)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液多糖含量的測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明,在不同碳源條件下,各處理多糖含量總體處于先下降后上升的趨勢(shì)。添加蔗糖為碳源的處理C2在液體培養(yǎng)的第5天,其發(fā)酵液中的多糖含量達(dá)最大值,其他各處理均在第6天出現(xiàn)了多糖含量的最高峰,但是各處理之間的差異較大,其中C1、C3、C4和C5處理的多糖含量較高,均在7 mg/mL左右。C8和CK兩個(gè)處理較低,在0～1 mg/mL之間浮動(dòng)。方差分析表明,C4甘薯淀粉和C1葡萄糖處理的含糖量極顯著高于其他處理 (表1)。

表1 樺褐孔菌F1菌株不同碳源發(fā)酵液在培養(yǎng)第6天的含糖量差異顯著性分析

(3)在液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液pH值的測(cè)定。由圖2可以看出,不同碳源條件下,樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液的pH變化情況基本一致,起始pH在4～4.5,隨著培養(yǎng)的進(jìn)行,發(fā)酵液pH呈緩慢上升趨勢(shì),至第8天終止發(fā)酵,發(fā)酵液pH值在5～6之間,前后變化不大。CK處理前4天pH上升明顯,第4天后呈緩慢上升趨勢(shì)。其中,C7乳糖處理的pH雖略有上升,但也基本保持在4.5左右。由此可以得出,樺褐孔菌F1菌株在培養(yǎng)過程中會(huì)不斷地分泌堿性物質(zhì)。

圖2 菌絲體碳源利用試驗(yàn)發(fā)酵液pH變化

(4)液體培養(yǎng)性狀觀察。終止發(fā)酵后,觀察菌球的培養(yǎng)性狀,結(jié)果C1、C6、C7處理的菌球表面分枝較長,其余處理分枝較短。C1、C7、C8和CK處理的菌球?yàn)楹稚?其余處理為米黃色。各處理均具有土腥味。觀察各發(fā)酵液的顏色及澄清度,C1、C8處理的發(fā)酵液為深褐色,C5、C6和C7為土黃色,其余為褐色。其中C1、C2、C8和CK的液體培養(yǎng)基在接種前為澄清,發(fā)酵終止后除CK外,另3個(gè)處理的發(fā)酵液仍為澄清。

通過對(duì)發(fā)酵液粗多糖含量、發(fā)酵培養(yǎng)性狀和菌球干重等測(cè)定得知,在所有供試碳源中,以葡萄糖和地瓜淀粉為最合適。

2.2 氮源利用試驗(yàn)的結(jié)果與分析

圖3 氮源試驗(yàn)菌球干重/g

(1)液體培養(yǎng)條件下菌球干重的測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示,以添加麩皮為氮源的處理N5所測(cè)得的菌球干重最大,為9.18 g/L;其次是N6玉米面處理和N4豆粉處理,分別為8.12 g/L和7.56 g/L;以N7蛋白胨為氮源的發(fā)酵液菌球干重最小,為2.96 g/L,CK的菌球干重與N7相近。由此看來,N5、N6、N4對(duì)于F1菌株液體培養(yǎng)來說是較好的氮源。

(2)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液在整個(gè)培養(yǎng)過程中,大多數(shù)處理的蛋白含量變化并不明顯,其中N4處理的變化幅度較大,開始上升緩慢,第10天起上升較快,達(dá)到2.54 mg/mL;N5處理的蛋白含量從第6天開始逐漸上升,終止發(fā)酵時(shí)為1.46 mg/mL;N1處理的蛋白含量在接種后第2天開始逐漸下降,終止發(fā)酵時(shí)僅為0.6 mg/mL。分析蛋白含量的影響因素,認(rèn)為菌絲體在生長代謝過程中利用培養(yǎng)基中蛋白營養(yǎng)的同時(shí),自身可能產(chǎn)生氨基酸、核酸等蛋白物質(zhì),因此在測(cè)定過程中不同處理的蛋白含量出現(xiàn)波浪式的變化。

圖4 氮源試驗(yàn)各處理蛋白質(zhì)含量

(3)液體培養(yǎng)條件下發(fā)酵液pH值的測(cè)定。圖5顯示,不同氮源條件下,樺褐孔菌F1菌株菌絲體發(fā)酵液pH變化不明顯,其中以N6處理的起始pH和終止pH在7～8之間變化,呈弱堿性,其他各處理從發(fā)酵開始到結(jié)束,pH值基本保持在4～6之間。從中也表明,樺褐孔菌F1菌株在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生酸性物質(zhì)。

(4)液體培養(yǎng)性狀觀察。發(fā)酵終止后,觀察各處理的菌球培養(yǎng)性狀,菌球顏色多為褐色,有細(xì)毛狀分枝;除N2、N3、N5、N8處理的發(fā)酵液混濁外,其余各處理的發(fā)酵液均澄清,多為褐色,具土腥味。

圖5 氮源試驗(yàn)pH值

根據(jù)氮源試驗(yàn)中蛋白質(zhì)含量、發(fā)酵液性狀、菌球干重等的綜合分析可知,在所有供試氮源中,蛋白胨是較為理想的。

3 結(jié)論

本研究分析比較了樺褐孔菌F1菌株對(duì)8種碳源和8種氮源的利用情況,表明以葡萄糖和地瓜淀粉為最佳碳源,以蛋白胨為最佳氮源。因試驗(yàn)是在單因素條件下進(jìn)行的,對(duì)無機(jī)鹽用量、初始pH等多因子的綜合交互效應(yīng)尚未涉及。

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