張青 肖和平 粟波

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海 200433)

張青 肖和平 粟波

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海 200433)

目的通過(guò)測(cè)定肺結(jié)核患者外周血CD4CDT細(xì)胞的表達(dá),探討CD4CDT細(xì)胞的的臨床意義>。方法2008年1月至2010年2月選取住院患者及門(mén)診做體檢的健康志愿者共78例,其中肺結(jié)核患者40例,門(mén)診健康志愿者38例,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定外周血 T細(xì)胞表面分子CD4、CD8、CD4CD,以百分比表示表面分子陽(yáng)性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例>。結(jié)果外周血CD4CDT細(xì)胞,肺結(jié)核組(1.9%±1.3%)明顯高于健康組(0.7%±1.0%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.237,P＜0.01)。外周血CD4T細(xì)胞,肺結(jié)核組(47.9%±11.2%)低于健康組(56.0%±14.6%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.830,P＜0.01)。外周血CD8T細(xì)胞,肺結(jié)核組(26.2%±6.1%)低于健康組(33.0%±11.1%),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.353,P＞0.05)。肺結(jié)核患者治療2月后,CD4CDT細(xì)胞(1.8%±0.8%)有下降,但與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.811,P＞0.05)。CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為=1.496,0.570,均P＞0.05)>。結(jié)論CD4CDT細(xì)胞參與了肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫過(guò)程,發(fā)揮抑制CD4和CD8T細(xì)胞的活化與增殖的作用,從而影響了患者的臨床演變及預(yù)后。

結(jié)核,肺/血液;T淋巴細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)

肺結(jié)核患者的臨床表現(xiàn)主要取決于宿主Th1/Th2免疫反應(yīng),T h1反應(yīng)通過(guò)形成肉芽腫來(lái)遏制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)[1],Th2反應(yīng)不但無(wú)法遏制結(jié)核分枝桿菌,還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌播散,形成空洞,肺部組織毀損等重癥肺結(jié)核,患者不但臨床癥狀嚴(yán)重,影像學(xué)也往往表現(xiàn)為多個(gè)大小不一的空洞及肺組織的廣泛浸潤(rùn),使治療非常棘手。機(jī)體T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度取決于宿主的免疫調(diào)節(jié)能力。近來(lái),調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(T reg)逐漸被現(xiàn)代免疫學(xué)者所重視并研究[2-3],這類細(xì)胞可以抑制周邊效應(yīng) T細(xì)胞(Teff)的功能,并且主要通過(guò)釋放抑制性細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-10,腫瘤生長(zhǎng)因子-β)或通過(guò)細(xì)胞接觸機(jī)制加以實(shí)現(xiàn)[4]。雖然它的表型各家報(bào)道不一,但幾個(gè)研究都認(rèn)為CD4CD是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較明確的表型[5-7]。同時(shí),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也表達(dá)特有的趨化因子,可誘導(dǎo)其自身遷徙至病灶部位,下調(diào)效應(yīng) T細(xì)胞的功能。因此,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)感染的免疫防御過(guò)程,但是它在肺結(jié)核患者中的變化還不清楚。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 受試者為2008年1月至2010年2月住院的肺結(jié)核患者及門(mén)診體檢志愿者共78例,其中男59例,女 29例,年齡18～71歲,平均(40±13)歲,體質(zhì)量指數(shù)＞18.5 kg/m2。

1.1.1 分組 (1)初治肺結(jié)核患者(簡(jiǎn)稱“肺結(jié)核組”)40例,共篩選符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的肺結(jié)核患者42例,1例痰分枝桿菌藥敏結(jié)果為耐多藥肺結(jié)核,1例合并干燥綜合征,故被排除。余40例用于本研究,其中男28例,女12例,平均年齡(41±15)歲。(2)同期選取在門(mén)診做體檢的健康志愿者38例(簡(jiǎn)稱健康組),共篩選了40例,1例PPD陽(yáng)性,1例血糖升高,均被排除,余 38例用于本研究,其中男21例,女17例,平均年齡(40±11)歲。他們的X線胸片未見(jiàn)異常,否認(rèn)有結(jié)核病史,無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎、過(guò)敏性疾病史及其他超敏反應(yīng)性疾病史,未服用過(guò)任何糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 初治肺結(jié)核的診斷參照《臨床診療手冊(cè)·結(jié)核病分冊(cè)》[8],并且痰分枝桿菌涂片檢查至少2次陽(yáng)性。結(jié)核分枝桿菌素試驗(yàn)采用5個(gè)國(guó)際單位結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物[9],硬結(jié)＜5 mm判斷為陰性。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、腫瘤的患者;痰分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的患者;藥物敏感試驗(yàn)提示為耐多藥結(jié)核病患者;HIV陽(yáng)性患者;PPD陽(yáng)性的健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 試劑及儀器 CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC單克隆抗體,試劑生產(chǎn)商為Beckman Coulter Immuntech SAS(13276 Marseille Cedex 9,France),以及Beckman Coulter Cytomics FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司,美國(guó))。

1.2.2 試驗(yàn)方法 40例肺結(jié)核患者簽署知情同意書(shū),在抗結(jié)核治療前及治療后2月用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血CD4、CD8、CD4CDT細(xì)胞的表達(dá)率。健康者僅測(cè)定 1次外周血CD4、CD8、CD4CDT細(xì)胞。采用肝素抗凝全血進(jìn)行熒光標(biāo)記,100 μ L全血分別先后加入CD4-ECD、CD8-ECD、CD25-FITC抗體室溫下孵育30 min,加0.5 ml OptiLyse C溶血素(Coulter公司,法國(guó))溶血,2 000 rpm 離心,加0.5 ml PBS洗滌重懸細(xì)胞待流式細(xì)胞儀分析。流式分析方案：在FS-SS雙參數(shù)圖上設(shè)門(mén)選定淋巴細(xì)胞群,在CD4-CD25雙參數(shù)圖上檢測(cè)雙陽(yáng)性細(xì)胞。CD25高表達(dá)的細(xì)胞群設(shè)定為CD,見(jiàn)圖1。采集軟件用 CXP Cytometer,分析軟件用CXP Analysis。

1.2.3 質(zhì)量控制 質(zhì)控管內(nèi)加入同型對(duì)照抗體IgG-ECD/IgG-FITC。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果采用x ±s描述。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,2組間均值的比較用Student's t檢驗(yàn),配對(duì)資料用配對(duì)t檢驗(yàn),構(gòu)成比采用Person χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 CD4-CD25雙參數(shù)圖

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2組受試者的一般情況見(jiàn)表1。年齡、性別構(gòu)成比及身高體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05),具有可比性。

表1 2組受試者的一般情況

2.3 治療前后T細(xì)胞亞群表達(dá)率的比較 40例肺結(jié)核患者治療 2月后復(fù)查外周血 CD4、CD8、CD4CDT細(xì)胞,與治療前比較的結(jié)果見(jiàn)表3。治療2月后CD4CDT細(xì)胞(1.8%±0.8%)有下降,但與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.811,P＞0.05)。CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞均有升高(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為=1.496,0.570,均P＞0.05)。

表2 2組受試者T細(xì)胞亞群表達(dá)率的比較(%)

表3 肺結(jié)核患者治療前后T細(xì)胞亞群表達(dá)率的比較(%)

3 討論

Th1型免疫反應(yīng)是控制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)所必須的基本條件[10],效應(yīng)T細(xì)胞在化學(xué)因子及其他趨化分子的驅(qū)動(dòng)下做選擇性遷徙,干預(yù)疾病的細(xì)胞免疫類型和強(qiáng)弱程度,使結(jié)核患者的免疫病理、臨床表現(xiàn)各不相同。Walrath J等[11]的研究表明,T h1、Th2型免疫反應(yīng)直接影響疾病的臨床嚴(yán)重程度,比如可表現(xiàn)為局限或是播散或形成空洞。Th1、Th2型效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的選擇性遷徙成為局部免疫的關(guān)鍵。但是,肺結(jié)核病人的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制除了上述重要因素外,還存在其他疑點(diǎn),尚未得到最終結(jié)論。

近10年來(lái)先后發(fā)現(xiàn)了很多不同來(lái)源的T細(xì)胞,其中針對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生作用的一類特殊T細(xì)胞亞群即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞逐漸引起了研究者的關(guān)注。這類細(xì)胞即可通過(guò)抑制免疫反應(yīng)緩解疾病,如自身免疫疾病和移植排斥[12],也可加速病理?xiàng)l件惡化,阻礙免疫反應(yīng),削弱宿主對(duì)病理過(guò)程的控制能力,如腫瘤和黑熱病[13]。本研究的結(jié)果提示肺結(jié)核患者外周血CD4CDhigh25T細(xì)胞含量明顯高于健康人,說(shuō)明肺結(jié)核病人存在著由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所致的免疫抑制。我們推測(cè)肺結(jié)核患者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不僅存在于血液循環(huán)系統(tǒng),還有很大一部分遷移至病灶部位,因?yàn)镃D4CD25+T細(xì)胞在炎癥因子和淋巴因子作用下特異性表達(dá)趨化因子受體CCR4和CCR8,與樹(shù)突狀細(xì)胞及吞噬細(xì)胞分泌的CCL17和CCL22趨化因子結(jié)合,引導(dǎo)CD4CD25+T細(xì)胞向炎癥部位和次級(jí)淋巴組織遷徙來(lái)阻止CD4CD25-T細(xì)胞的活化[14]。盡管效應(yīng)T細(xì)胞也在化學(xué)因子的作用下遷徙到病灶部位,但由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以發(fā)揮更強(qiáng)的抑制作用,使效應(yīng)T細(xì)胞不足以提供有效的免疫保護(hù),進(jìn)而Th1型效應(yīng)T細(xì)胞被抑制,機(jī)體失去了阻止疾病惡化的能力。體外試驗(yàn)結(jié)果表明,將CD4CDhigh25T細(xì)胞從活動(dòng)性結(jié)核病患者外周血中剝奪后,再用分枝桿菌抗原刺激,外周血細(xì)胞分泌更多的干擾素-γ,而結(jié)核潛伏感染和健康人無(wú)此現(xiàn)象[15],說(shuō)明CD4CDT細(xì)胞只在結(jié)核病活動(dòng)期下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)。因此,結(jié)核病人的細(xì)胞免疫與CD4CDT細(xì)胞密切相關(guān)。

本文的結(jié)果還提示,肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者比較,外周血的CD4CD調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯升高,而CD4T細(xì)胞數(shù)量明顯減低,CD8T細(xì)胞數(shù)量也略低,在抗結(jié)核治療2月后,上述指標(biāo)均有所恢復(fù),說(shuō)明CD4CDT細(xì)胞發(fā)揮了抑制CD4和CD8T細(xì)胞的活化與增殖的作用,與某些報(bào)道一致[7,16]。但因本研究治療的時(shí)間較短,所觀察的指標(biāo)在治療前后的差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著治療的不斷延續(xù),肺結(jié)核患者的免疫抑制將逐漸改善。本研究之所以測(cè)定以CD4CD為表型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,是為了使其具有更好的同源性。早期的某些研究都用CD4CD25雙陽(yáng)性來(lái)代表調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,但引發(fā)了很多人的質(zhì)疑,因?yàn)橛行┗罨腡細(xì)胞表面也同樣表達(dá)CD25,所以單純CD4CD25+不能反映調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的真正含量。

本研究的不足之處在于未能進(jìn)行CD4CD25+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3或其mRNA的檢測(cè),因此無(wú)法深入了解CD4CD25+T細(xì)胞的細(xì)胞水平及功能活性。

由上提示Treg參與了肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫過(guò)程,與Teff同樣發(fā)揮著重要作用,可以推動(dòng)免疫向促炎方向發(fā)展,或是向免疫抑制方向發(fā)展,從而影響了肺結(jié)核患者的臨床演變及預(yù)后。

[1]Lazarevic V,Dawn N,Fly nn JL.Long-term control ofMycobacterium tuberculosisinfection is mediated by dy namic immune responses[J].J Immunol,2005,175(2)：1107-1117.

[2]Fontenot JD,Rasmussen JP,Williams LM,Dooley JL,Farr AG,Rudensky A Y.Regulatory T cell lineage specification by the fork head transcription factor foxp3[J].Immunity,2005,22(3)：329-341.

[3]Belkaid Y,Rouse BT.Natural regulatory T cells in infectious disease[J].Nat Immunol,2005,6(4)：353-360.

[4]Pandiyan P,Zheng L,Ishihara S,Reed J,Lenardo MJ.CD4CD25+Foxp3+regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4T cells[J].Nat Immunol,2007,8(12)：1353-1362.

[5]Chiacchio T,Casetti R,Butera O,Vanini V,Carrara S,Girardi E,Di Mitri D,Battistini L,M artini F,Borsellino G,Goletti D.Characterization of regulato ry T cells identified as CD4(+)CD25(hig h)CD39(+)in patients with active tuberculosis[J].Clin Ex p Immunol,2009,156(3)：463-470.

[6]M ahan CS,T homas JJ,Boom WH,Rojas RE.CD4CD25(high)Foxp3+regulatory T cells down regulate human Vdelta2+T-lymphocyte function triggered by anti-CD3 o r phosphoantigen[J].Immunology,2009,127(3)：398-407.

[7]Li L,Lao SH,Wu CY.Increased frequency of CD4(+)CD25(hig h)T reg cells inhibit BCG-specific induction of IFN-gamma by CD4(+)T cells from TB patients[J].T uberculosis,2007,87(6)：526-534.

[8]中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床診療手冊(cè)(結(jié)核病分冊(cè))[M].北京：人民出版社,2005：80.

[9]American Tho racic Society.T argeted tuberculin testing and treatment of latent tuberculosis infection.Am J Respir Crit Care Med,2000,161(suppl)：S221-S247.

[10]Derrick SC,Evering T H.Characterization of the protective T-cell response generated in CD4-deficient mice by a live attenuatedMycobacterium tuberculosisvaccine[J].Immunology,2007,120(2)：192-206.

[11]Walrath J,Zukowski L.Resident Th1-like effector memory cells in pulmonary recall responses toMycobacterium tuberculosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,33(1)：48-55.

[12]Piccirillo CA,Shevach EM.Naturally-occurring CD4CD25+immuno regulatory T cells：central players in the arena of peripheral tolerance[J].Semin Immunol,2004,16(2)：81-88.

[13]Suffia IJ,Reckling SK,Piccirillo CA,Goldszmid RS,Belkaid Y.Infected site-restricted Fox p3+natural regulatory T cells are specific for microbial antigens[J].J Ex p Med,2006,203(3)：777-788.

[14]Lellem A,M ariani M,Lang R,Recalde H,Panina-Bordig non P,Siningaglia F,D'Ambrosio D.Unique chemotactic response profile and specific ex pression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4CD25+regulatory T cells[J].J Exp Med,2001,194(6)：847-885.

[15]Jean-Michel Hougardy,Virginie Verscheurea,Camille Locht,Francoise Mascart.In vitro expansion of CD4tCDFOXP3+CD127low/-regulatory T cells from peripheral blood lymphocytes of healthyMycobacterium tuberculosis-infected humans[J].Microbes Infect,2007,9(11)：1325-1332.

[16]Chen X,Zhou B,Li M,Deng Q,Wu X,Le X,Wu C,Larmonier N,Zhang W,Zhang H,Wang H,Katsanis E.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells suppressMycobacterium tuberculosisimmunity in patients with active disease[J].Clin Immunol,2007,123(1)：50-59.

Clinical significance of CD4CDT cells in patients with pulmonary tuberculosis

Zhang Qing,Xiao Heping,Su Bo
Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University,Tongji University School of Medicine,Shanghai200433,China

ObjectiveTo observe the clinical significance of CD4CDhigh25T cells from peripheral blood in pulmonary tuberculosis(PTB)patients.MethodsFrom January 2008 to February 2010,40 hospitalized PTB patients and 38 healthy controls from outpatient department for physical examination were enrolled.CD4,CD8 and CD4CDT cells which were presented by their percentages in peripheral blood lymphocytes of the above subjects were assessed by flow cytometry.ResultsThe frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.9%±1.3%)were significantly higher than that in healthy controls(0.7%±1.0%)(t=5.237,P＜0.01).The frequencies of CD4T cells in PTB patients(47.9%±11.2%)were significantly lower than that in healthy controls(56.0%±14.6%)(t=2.830,P＜0.01).The frequencies of CD8T cells in PTB patients(26.2%±6.1%)were somewhat lower than that in healthy controls(33.0%±11.1%),but there was not statistical difference(t=0.353,P＞0.05).After 2 months of anti-TB treatment,the frequencies of CD4CDT cells in PTB patients(1.8%±0.8%)were decreased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=0.811,P＞0.05),while the frequencies of CD4T cells and CD8T cells in PTB patients(51.6%±14.4%,33.7%±11.5%)were all increased as compared with pre-treatment but without statistic significance(t=1.496,0.570,respectively,all P＞0.05).ConclusionsCD4CDT cells are involved in cellular immune of PTB patients,inhibiting the activation and proliferation of CD4 and CD8T cells,affecting the clinical manifestations and prognosis of PTB.

tuberculosis,pulmonary/blood;T-lymphocytes;flow cytometry

Zhang Qing(zhqi709851@sohu.com)

張青(zhqi709851@sohu.com)

2010-07-11)

(本文編輯：張曉進(jìn))