劉鵬，江建明

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨病外科，廣州 510515）

抗結(jié)核藥物不易滲入骨病灶［1，2］，而在抗結(jié)核藥物治療的基礎(chǔ)上實施手術(shù)清除病灶，有利于抗結(jié)核藥物滲入病灶，可縮短療程，提高治愈率。因此，在明確病灶切除范圍、徹底清除病灶的前提下，最大限度減少手術(shù)創(chuàng)傷，是脊柱結(jié)核外科治療的關(guān)鍵問題。利福平（rifampicin，RFP）是一線抗結(jié)核藥物，國內(nèi)外對RFP的血藥濃度及原藥檢測已有報道［3，4］。本文利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立了測定患者病椎、血漿及正常骨組織中RFP及其代謝產(chǎn)物去乙酰利福平（25-desacetylrifampicin，De-RFP）的方法，并對不同節(jié)段亞健康骨中的原藥及代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測，以期為脊柱結(jié)核手術(shù)方法的改進(jìn)及化療方案的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 最小樣本量的估計：多樣本均數(shù)的比較：

1.1.2 研究對象：選取我科2008年1月至12月期間應(yīng)用2SHRZ/6H2R2Z2短程化療方案（共8個月）［5］（煙肼 0.3、RFP 0.45、鏈霉素 0.75、吡嗪酰胺 1.5）結(jié)合手術(shù)治療的初治脊柱結(jié)核患者36例。男15例，女21例；年齡23～75歲，平均47歲；發(fā)病部位：頸椎2例，胸椎5例，胸腰椎10例，腰椎16例，腰骶椎3例。36例患者均具備手術(shù)指征，肝、腎功能均正常，入院抗結(jié)核治療4周后行手術(shù)治療。術(shù)前行CT了解病椎情況，其中23例病椎無硬化骨，歸入非硬化骨組，13例含有病椎硬化骨，歸入硬化骨組。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集：術(shù)晨統(tǒng)一空腹服藥并記錄時間，術(shù)中取患者血液、病灶（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）、“亞健康骨”（病灶周圍肉眼觀察正常的骨組織）及髂骨。臨床病理學(xué)研究證實，病灶周圍4 mm范圍內(nèi)的亞健康骨中仍然存在微小病灶［6］，故亞健康骨按病灶邊緣4mm范圍內(nèi)（A段亞健康骨）、外（B段亞健康骨）取材。每次取樣時間嚴(yán)格控制在服藥后2 h以內(nèi)，以保證各藥血藥濃度達(dá)到峰值，提高檢出率。

1.2.2 樣品預(yù)處理：靜脈血5 mL置于肝素抗凝玻璃試管（每管加VC 1 mg抗氧化），4 000 r/min離心15 min得血漿，再轉(zhuǎn)入eppendorf管，置于－70℃待測。病椎及髂骨用濾紙拭血后稱質(zhì)量（均＞0.5 g），置液氮冷凍后，迅速取出研磨成粉，置于－50℃避光冷凍干燥，再稱質(zhì)量并計算組織樣本的干濕質(zhì)量比。分析天平精確稱取200μg，加入甲醇提取液2 mL，渦旋10 min后離心，取上清液制成骨組織提取液，取1 mL放入eppendorf管中留待測定其中的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）含量。空白對照血漿為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血庫提供的近期健康人血漿，－40℃冷凍保存；空白對照骨取自非結(jié)核的脊柱骨折患者前路手術(shù)切取的椎體骨，與樣本骨同法制備成空白對照骨組織勻漿。

1.2.3 實驗部分：（1）色譜條件：色譜柱為分析柱shim-pack HRC-C8（250 mm×4.6 mm，5μm），保護(hù)柱Eclipse XDB-C18（125 mm×4.6 mm）；流動相為 0.02 mol/L，庚烷磺酸鈉溶液（pH 3.0）-乙腈-甲醇=20∶5∶75，流速為 0.8 mL/min，測試波長 254 nm。（2）試劑與儀器：RFP、VC（標(biāo)準(zhǔn)品由廣州市藥檢所提供），De-RFP參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行配制，甲醇（色譜純，美國Sigma公司），高效液相色譜儀（LC2010C，日本島津公司），Lc-solution型色譜工作站。（3）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將空白血漿（圖1）加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成含RFP 及 DE-RFP 分 別 為 0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、16 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿（圖2），以2種藥物的峰面積為X軸，3種藥物的濃度為Y軸做線性分析。得2藥回歸方程：YRFP=3 007.2X+3 714.58，YDe-RFP=2 736.6X+3 380.27。（4）樣本測試：將血漿200μL加入甲醇1 mL沉淀蛋白后離心取上清液，氮氣吹干后甲醇定標(biāo)到200μL，骨組織提取液則直接取200μL，氮氣吹干后甲醇定標(biāo)到200μL，進(jìn)樣體積為20μL。得色譜圖（圖3）后按照峰面積所得值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求得血漿及骨勻漿中的藥物濃度。再根據(jù)稀釋比（1∶1 0）、組織的干濕質(zhì)量比，換算得出髂骨與病椎中藥物的濃度，再由所測的Hb含量（國際血液病學(xué)會推薦的HICN法［8］）經(jīng)校正公式計算求得各組分的校正組織濃度。組織樣本中歸因血污染的藥物濃度由以下公式計算［9］：歸因血污染的藥物濃度［K為組織稀釋因子，S為血漿藥物濃度（μg/mL），Ht為血細(xì)胞比容（%）］。

圖1 空白血漿進(jìn)樣后色譜Fig.1 Chromatogram of blank plasma after injection

圖2 空白血漿添加RFP、De-RFP后進(jìn)樣色譜圖Fig.2 Chromatogram of plasma with RFP and De-RFP after injection

圖3 組織樣本進(jìn)樣后色譜圖Fig.3 Chromatogram of tissue sample after injection

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，各組實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多樣本均數(shù)比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血漿樣本測試結(jié)果

RFP和De-RFP血藥濃度與文獻(xiàn)報道健康人單次服藥的藥時數(shù)據(jù)相近，36例血液樣本測試結(jié)果為：RFPmax=7.77 mg/L、RFPmin=2.70 mg/L、RFPmean=5.13 mg/L；De-RFPmax=7.84 mg/L、De-RFPmin=5.79 mg/L、De-RFPmean=3.74 mg/L。血漿中RFP原藥及代謝產(chǎn)物De-RFP濃度高于髂骨、“亞健康骨”及病椎組織中的藥物濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 硬化骨測試結(jié)果

含有硬化骨的13例病灶中（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）未能測出藥物濃度，A段亞健康骨藥物濃度比B段亞健康骨低，比髂骨中藥物濃度低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；B段亞健康骨藥物濃度與髂骨接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 服藥后2 h硬化骨組抗結(jié)核藥物濃度檢測結(jié)果（x±s）Tab.1 Concentration of antituberculosis drugs in sclerotic group 2 hours after medication（x±s）

2.3 非硬化骨測試結(jié)果

23例非硬化骨的病例病灶中（包括死骨、干酪樣壞死及膿液）藥物濃度明顯低于A、B 2段亞健康骨，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而 A、B 2段亞健康骨與髂骨之間藥物濃度無統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。

表2 服藥后2 h非硬化骨組抗結(jié)核藥物濃度檢測結(jié)果（x±s）Tab.2 Concentration of antituberculosis drugs in non-sclerotic group 2 hours after medication（x±s）

2.4 臨床治療結(jié)果

全部患者采用2SHRZ/6H2R2Z2（共8個月）方案化療結(jié)合結(jié)核病椎部分切除、植骨、內(nèi)固定治療。術(shù)中結(jié)核病椎切除范圍包括全部的硬化壁及其空洞內(nèi)的肉芽、壞死干酪樣組織及距病灶邊緣4 mm以內(nèi)“亞健康骨”。隨訪8～20個月，36例患者術(shù)后3個月內(nèi)結(jié)核病全身癥狀消失，血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）轉(zhuǎn)為正?；蚧菊＃骄补墙缑嫒诤蠒r間5個月，隨訪1.5年后，除1例因術(shù)后3個月內(nèi)自行停藥復(fù)發(fā)以外，其余無復(fù)發(fā)。

3 討論

利福平仍是當(dāng)今一線抗結(jié)核藥物，目前已知RFP的體外最低抑菌濃度（MIC）為0.025~0.05 μg/mL［10］，公認(rèn)的有效殺菌濃度應(yīng)為試管內(nèi)MIC的10倍以上［11］。RFP口服吸收可達(dá) 90%～95%，于 1～2 h血藥濃度達(dá)峰值，易滲入機(jī)體組織、體液（包括腦脊液）中，有效濃度可維持約6 h。RFP在肝臟中可在自身誘導(dǎo)微粒體氧化酶的作用下迅速去乙酰化，成為具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物De-RFP。t1/2為2～5 h，服藥后1.5～4 h血藥濃度達(dá)峰值。以往已有采用液相色譜法檢測血液及骨骼中RFP的報道［12］，而本研究采用HPLC法建立了可檢測患者病椎各部位、血漿、正常骨組織及不同節(jié)段的亞健康骨中RFP原藥及其代謝產(chǎn)物De-RFP的方法。13例硬化骨病灶中未能檢測出藥物濃度，B段亞健康骨中RFP藥物濃度達(dá)到MIC的10倍以上（即達(dá)到有效殺菌濃度水平），與自身對照的髂骨濃度相當(dāng)；而A段亞健康骨中的RFP藥物濃度卻在MIC的10倍以下。23例非硬化骨的病灶中藥物濃度均在MIC的10倍以下，A、B 2段亞健康骨中RFP的藥物濃度均達(dá)到MIC的10倍以上。結(jié)果提示，硬化骨可能起阻隔藥物滲透的屏障作用，外圍健康椎體骨組織中高濃度的RFP及其代謝產(chǎn)物De-RFP難以穿越此層結(jié)構(gòu)滲透到病灶當(dāng)中，而距硬化骨較近的A段亞健康骨中的藥物濃度仍較低，較遠(yuǎn)的B段亞健康骨中的藥物濃度相對較高。

目前我國結(jié)核病人數(shù)居世界第2位，耐藥率從20世紀(jì)90年代漸呈上升趨勢，并有難治的耐多藥（MDR-TB）出現(xiàn)［13，14］。據(jù)文獻(xiàn)報道，獲得性耐多藥占79.4%，其中又以醫(yī)源性不規(guī)則用藥史者為多［15］?；熍浜霞怪Y(jié)核病灶清除術(shù)治療不僅直接清除了壞死的病灶，還打通了阻礙血液運載藥物進(jìn)入病灶的板障，提高了病灶局部的血藥濃度。及時檢測患者化療后的血液及骨骼中的藥物濃度，不僅是化療本身的重要參考，也是清除病灶的依據(jù)。本研究所建立的HPLC檢測方法有助于明確術(shù)中亞健康骨切除的范圍，為脊柱結(jié)核病灶清除術(shù)治療提供定量依據(jù)。本方法不僅可檢測RFP原藥血藥濃度，還可檢測其代謝產(chǎn)物De-RFP的濃度，檢測這種具有殺菌活性和肝臟毒性的物質(zhì)對結(jié)核化療患者的藥物濃度監(jiān)測及安全用藥有一定的臨床意義。本研究結(jié)果表明，包裹在硬化壁內(nèi)的病灶難以達(dá)到有效的藥物濃度，手術(shù)應(yīng)徹底清除包括死骨、肉芽、壞死、干酪樣組織的病灶；鄰近的亞健康骨內(nèi)藥物濃度亦相對較低，這一部分亞健康骨也應(yīng)予以清除；而對無硬化骨的病例手術(shù)清除病灶時直達(dá)亞健康骨，亦可取得良好的療效。

［1］Tuli SM，Kumar K，Sen PC.Penetration of antitubercular drugs in clinical osteoarticular tubercular lesions ［J］.Acta Orthop Scand，1977，48（4）：362-368.

［2］Kumar K.The penetration of drugs into the lesionsof spinal tuberculosis［J］.Int Orthop，1992，16（1）：67-68.

［3］He X，Wang J，Liu X，et al.High-performance liquid chromatography assay of rifapentine in human serum ［J］.Chromatographia，1996，681（2）：412-415.

［4］Panchagnula R，Sood A，Sharda N，et al.Determination of rifampicin and its main metabolite in plasma and urine in presence of pyrazinamide and isoniazid by HPLCmethod ［J］.JPharm Biomed Anal，1999，18（6）：1013-1020.

［5］馬遠(yuǎn)征.脊柱結(jié)核的治療應(yīng)遵循個體化綜合治療原則［J］.中華外科雜志，2007，45（18）：1227-1229.

［6］Zhang G，Wu Q，Guan Y，et al.Spinal tuberculosis ［M］.Beijing：People′s Military Medical Press，2007：266-267.

［7］Maggi N，Vigevani A，Pallanza R.Desacetyl-rifamycins：preparation and antibacterial properties［J］.Experientia，1968，24（3）：209-211.

［8］Van Assendelft OW，Zijlstra WG，Buursma A，et al.Theuseof atomic absorption spectrophotometry for the measurement of haemoglobiniron，with special reference to the determination of epsilon（540）（HiCN）［J］.Clin Chim Acta，1968，22（2）：281-289.

［9］Roncoroni AJ，Manuel C，Nedjar C，et al.Cefamandolebonediffusion in patients undergoing total hip replacement ［J］.Chemotherapy，1981，27（3）：166-172.

［10］謝惠安，陽國太，林善梓，等.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：510-527.

［11］徐叔云.中華臨床藥理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：384-399.

［12］戈朝暉，王自立，魏敏吉.利福平在脊柱結(jié)核患者不同組織分布的實驗研究［J］.中國脊柱脊髓雜志，2004，14（12）：741-744.

［13］Mukherjee JS，Rich ML，Socci AR，et al.Programmesand principles in treatment of multidrug-resistant tuberculosis ［J］.Lancet，2004，363（9407）：474-481.

［14］全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告［J］.中國防癆雜志，2002，24（2）：65-108.

［15］Yagui M，Perales MT，Asencios L，et al.Timely diagnosis of MDRTB under program conditions：is rapid drug susceptibility testing sufficient?［J］.Int JTuberc Lung Dis，2006，10（8）：838-843.