鄧 翀，顏永剛，姚天鵝

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

白鮮皮為蕓香科植物白鮮 (Dictamnus dascarpus Turczl)的干燥根皮，是一種常見的中草藥，為歷代本草及中國(guó)藥典收藏。別名有白鮮，蘚皮，地羊膻，金雀兒椒，八股牛，白羊鮮等。其味咸，苦，性寒，具清熱燥濕，祛風(fēng)解毒，止癢等功效。臨床用于濕熱瘡毒，黃水淋漓，濕疹，風(fēng)疹，疥癬瘡癩，風(fēng)濕熱痹，黃疸尿赤等癥[1]。目前對(duì)白鮮皮提取工藝的研究報(bào)道主要以總浸膏量和白鮮堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究[2－3]。由于總浸膏量為評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏準(zhǔn)確性以及白鮮堿為評(píng)價(jià)指標(biāo)的單一性，本實(shí)驗(yàn)從整體化學(xué)成分角度，以HPLC化學(xué)指紋圖譜的多成分相對(duì)含量為控制指標(biāo)考察白鮮皮的提取工藝，篩選白鮮皮提取工藝。為白鮮皮提取分離提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效色譜儀 (L－2130二元泵，L－2400檢測(cè)器，日本日立公司)，電子天平 (薩多利斯GB2042電子天平 (瑞典)，0.1mg)，電熱恒溫水浴鍋 (北京市光明醫(yī)療儀器廠)。

1.2 材料

白鮮皮采集于陜西省太白山紅河谷 (由陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師采集并鑒定);白鮮堿對(duì)照品 (購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111654－200301);色譜乙 (科密歐公司);水為娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備

精密稱取白鮮皮藥材粉末 (60目篩)約5g，以適當(dāng)?shù)娜軇樘崛∪苊?，按照?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行提取，濾過，提取液在80℃水浴濃縮，揮干溶媒，以95%乙醇溶解，定容于100mL量瓶中。儲(chǔ)存于4℃，冷藏待用。

2.1.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱取白鮮堿對(duì)照品10.81mg，以甲醇溶解，定容在25mL的量瓶中作為對(duì)照品母液，濃度為0.4324mg/mL;精密吸取對(duì)照品母液2.0mL，以甲醇定容在10mL量瓶中，作為對(duì)照品溶液，濃度為0.08648mg/mL。

2.2 指紋圖譜測(cè)定方法建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特C18色譜柱;流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液;梯度洗脫程序:0～10min，A相5%～20%;10～15min，A相20%～30%;15～25min，A相30%～30%;25～40min，A相30%～45%;40～60min，A相45%～65%;60～70min，A相65%～100%;70～75min，A相100%～100%[4]。檢測(cè)波長(zhǎng):228nm;流速:1mL/min;溫度:室溫;進(jìn)樣量:10μL。對(duì)照品白鮮堿色譜圖見圖1，指紋圖譜色譜圖見圖2。

2.2.2 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，28個(gè)共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于3%，28個(gè)共有峰面積RSD不超過5%，表明進(jìn)樣的精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一供試品5份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品并測(cè)定，28個(gè)共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于3%，28個(gè)共有峰面積RSD不超過5%，表明其重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12h檢測(cè)，28個(gè)共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于3%，28個(gè)共有峰面積RSD不超過5%，說明供試品溶液至少在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 提取溶劑選擇

取白鮮皮藥材粗粉末 (過4號(hào)篩)5g，分別用8倍量甲醇、乙醇和0.2%鹽酸水溶液為提取溶媒，超聲30min，按“2.2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，根據(jù)“2.8項(xiàng)”下計(jì)算方法計(jì)算，選擇提取溶劑。

2.4 提取方式選擇

取白鮮皮藥材粗粉末 (過4號(hào)篩)，等量精密稱取2份，8倍量的以95%乙醇為溶劑，分別用超聲法、回流法提取，制備成等體積的溶液。按“2.2.1項(xiàng)”下色譜條件測(cè)定，根據(jù)“2.8項(xiàng)”下計(jì)算方法計(jì)算，選擇提取方式。

2.5 正交試驗(yàn)法研究白鮮皮提取工藝

對(duì)影響醇提取工藝的主要因素溶媒濃度 (因素A)、溶劑用量 (因素B)、提取次數(shù) (因素C)和提取時(shí)間 (因素D)進(jìn)行L9(34)實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.6 樣品測(cè)定

取正交實(shí)驗(yàn)法項(xiàng)下的9個(gè)供試品溶液吸取20μL，以指紋圖譜測(cè)定條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2.7 評(píng)價(jià)方法

用多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)公式法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[5]。以Xij表示第i次實(shí)驗(yàn)中第j個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值 (即Xij表示正交實(shí)驗(yàn)的第i次實(shí)驗(yàn)的色譜圖中第j個(gè)色譜峰峰面積值，其中在正交實(shí)驗(yàn)各次實(shí)驗(yàn)的色譜圖中所選定的色譜峰是根據(jù)活性部位指紋圖譜而確定的，它們相對(duì)應(yīng)的色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間是一致的)，i=1，2，…，n;j=1，2，…，k。首先以各指標(biāo)的最大值 (即各色譜圖中同一相對(duì)保留時(shí)間的各色譜峰中峰面積值最大者)作為參照，對(duì)同一指標(biāo)各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Dij表示第j個(gè)指標(biāo)下的第i個(gè)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

再按各指標(biāo)的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差確定加權(quán)系數(shù)。以SDj表示第j個(gè)指標(biāo)下Dij的標(biāo)準(zhǔn)差，以RSDj表示第j個(gè)指標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，則根據(jù)各指標(biāo)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差賦權(quán)為RSD/RSDj，其中RSD為指定指標(biāo) (參照物白鮮堿)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差;根據(jù)各指標(biāo)的重要程度賦權(quán)為Ej，由于不能確定各組分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)大小，故認(rèn)為指紋圖譜中的各個(gè)色譜峰 (群)所代表的各組分 (群)都很重要，均設(shè)為1。結(jié)合各指標(biāo)的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差確定的權(quán)重系數(shù)為:

因此，多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)公式為:

[3]式計(jì)算所得的兼顧各指標(biāo)綜合效應(yīng)的公式，得分越大越好。

3 結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果表

3.1 提取溶媒選擇結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，甲醇、乙醇和0.2%鹽酸水溶液3種提取溶媒的綜合評(píng)分分別為56.43372，70.30897，55.69554。故本實(shí)驗(yàn)選擇不同乙醇為提取溶媒。

3.2 提取方式選擇結(jié)果

根據(jù)對(duì)超聲和回流提取方式實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較，超聲和回流兩種提取方式綜合評(píng)分分別為66.73388，71.04552，故本實(shí)驗(yàn)選擇回流為提取方式。

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在前述提取條件初篩的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)溶媒濃度、提取溶劑倍量、回流時(shí)間、回流次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。將各白鮮皮提取液分別定容至25mL量瓶中，0.45μm濾膜濾過后，用“2.2.1項(xiàng)”色譜法測(cè)定各溶液中28個(gè)共有峰面積為指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果及極差分析見表2，方差分析見表3。

表3 公式評(píng)分方差分析表

以多指標(biāo)實(shí)驗(yàn)公式法統(tǒng)計(jì)分析P值為考察指標(biāo)，由表2中極差R值大小顯示，各因素作用主次為A＞D＞C＞B;由表3中方差分析結(jié)果表明[6]:因素A具有顯著性差異，以A2B3C1D2組合為佳，即最佳工藝條件為料液比12倍，乙醇濃度75%，提取次數(shù)1次，提取時(shí)間1.5h。

3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)A2B3C1D2工藝條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該工藝的合理性和穩(wěn)定性，結(jié)果無(wú)顯著性差異，RSD值為2.433。最后確定的最佳提取工藝為料液比12倍，乙醇濃度75%，提取次數(shù)1次，提取時(shí)間1.5h。

4 討論

中藥藥效是多成分、多靶點(diǎn)整體作用的結(jié)果，在對(duì)中藥的提取工藝優(yōu)選過程中，若只采用某單體成分含量為優(yōu)化指標(biāo)，不能反映全方的整體效應(yīng)。在以往對(duì)中藥的提取工藝研究中，往往只局限于以干浸膏得率、單體含量和化學(xué)部位含量為指標(biāo)進(jìn)行工藝的優(yōu)選，具有一定的局限性。本文對(duì)白鮮皮醇提工藝優(yōu)化的過程中，嘗試采用未知結(jié)構(gòu)成分的模糊數(shù)據(jù) (特征色譜峰面積之和)相結(jié)合的形式，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)定優(yōu)化提取工藝，較之于以往可以更全面地反映提取物的成分信息。

盡管指紋圖譜可以提供較為豐富的中藥提取物信息，但是本實(shí)驗(yàn)中采用紫外檢測(cè)器，只能提供藥液中具有紫外吸收的成分的相對(duì)含量信息;且指紋峰所對(duì)應(yīng)成分的藥效作用尚不完全清楚，在中藥提取工藝的優(yōu)化方面尚不能實(shí)現(xiàn)所有藥效組分的提取與檢測(cè)。在未來工作中，有待于結(jié)合現(xiàn)代高通量篩選技術(shù)，追蹤各成分的藥物活性;同時(shí)，可以嘗試建立藥液的液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜，借助質(zhì)譜等更加靈敏、通用的檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行全成分的高效分析、檢測(cè)，提高中藥制劑的提取效率和制劑水平，推進(jìn)中藥研究的現(xiàn)代化進(jìn)程。

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(2010年版)一部 [M]．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:92．

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[5]韓可勤，楊靜化，劉曉東．藥學(xué)應(yīng)用概率統(tǒng)計(jì)[M]．南京:東南大學(xué)出版社，2000:1301．

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