孫長(zhǎng)崗 ，杜忠海 ，賀珊珊

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250012;2濰坊市中醫(yī)院;3濰坊醫(yī)學(xué)院)

研究表明，息賁膠囊聯(lián)合化療治療中晚期非小細(xì)胞肺癌能夠明顯降低化療毒副反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期[1]。息賁膠囊能夠抑制腫瘤細(xì)胞 DNA合成和復(fù)制，降低端粒酶活性，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，進(jìn)而阻滯 Lewis肺癌細(xì)胞增殖過(guò)程[2]。2010年 6～8月，我們通過(guò)觀察息賁膠囊對(duì)小鼠 Lewis肺癌組織 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示其抗腫瘤的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(H-2Kb)77只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安全公司產(chǎn)品)、TGL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品)、HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(軟包購(gòu)自武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司)、37℃電熱恒溫水浴箱(上海恒豐儀器儀表有限公司產(chǎn)品)、恒溫冰凍切片機(jī)(德國(guó) Leica公司產(chǎn)品)。Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco公司;小鼠 Bax、Bcl-2單克隆抗體和 Caspase-3單克隆抗體均為 NeoMarkers生物技術(shù)公司產(chǎn)品;免疫組化 SABC試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)用藥為息賁膠囊(由濰坊市中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，每粒 1.0 g，相當(dāng)于生藥 5 g)、順鉑(齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:H37021357，20 mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 取接種 Lewis肺癌 10～14天的 C57BL/6荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無(wú)菌條件下取瘤組織，按腫瘤質(zhì)量(g)與生理鹽水(ml)1∶3制備瘤細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過(guò)濾，1 500 r/min離心5 min，用生理鹽水調(diào)成濃度約 1×107/ml腫瘤細(xì)胞。取 77只小鼠，在右前腋皮下接種 Lewis肺癌瘤細(xì)胞懸液，每只 0.2 ml。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理方法 接種 24 h后，將小鼠分別按體質(zhì)量標(biāo)號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法將 77只小鼠完全隨機(jī)分為 5組:生理鹽水組 16只、息賁膠囊低劑量[25 g/(kg? d)]組 16只、息賁膠囊中劑量[37.5 g/(kg? d)]組 15只、息賁膠囊高劑量[50 g/(kg?d)]組 15只、順鉑組 15只。各組小鼠于用藥第 21天脫頸處死，剝?nèi)×鰤K，切取部分腫瘤組織，浸于10%甲醛溶液固定，48 h內(nèi)常規(guī)石蠟包埋。

1.2.3 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表達(dá)檢測(cè) 采用SABC法，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，顯微鏡下觀察，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄各自的積分光密度值(IOD值)作為蛋白表達(dá)的量化指標(biāo)。每張切片用顯微鏡圖像采集系統(tǒng)采集圖像，并用 Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性顯色的平均 IOD測(cè)定，平均 IOD=平均光密度 ×表達(dá)面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，生理鹽水組及息賁膠囊低劑量組各有 1只小鼠灌胃死亡，生理鹽水組另有 1只小鼠第 18天時(shí)死亡。各組小鼠瘤組織中均有不同程度 Bcl-2、Bax和 Caspase-3蛋白表達(dá)。與生理鹽水組比較，各息賁膠囊組 Bax和 Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05或 ＜0.01)，而且效應(yīng)與劑量呈正相關(guān)(r=0.625，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 小鼠 Lewis肺癌組織中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表達(dá)(±s)

表1 小鼠 Lewis肺癌組織中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表達(dá)(±s)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與順鉑組比較，△P＜0.01;與息賁膠囊高劑量組比較，★P＜0.01;與息賁膠囊中劑量組比較，●P＜0.05

組別 n Bax(×103) Bcl-2(×103) Bax/Bcl-2 Caspase-3(×103)生理鹽水組 14 1.98±0.23 12.36±1.14 0.15±0.02 2.59±0.17息賁膠囊低劑量組 15 2.72±0.17*★●△ 5.90±0.29**★△ 0.44±0.03**★△● 3.31±0.25*★△息賁膠囊中劑量組 15 3.40±0.32**★△ 4.49±0.26**★△ 0.75±0.09**★△ 3.75±0.42*★△息賁膠囊高劑量組 15 19.92±1.17** 2.49±0.47** 8.02±0.47** 8.13±0.46**順鉑組 15 17.37±0.69** 2.12±0.31** 6.31±0.35** 7.69±0.37**

3 討論

Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡重要的調(diào)控者，包括抑凋亡基因如 Bcl-2和促凋亡基因如 Bax。Bcl-2和 Bax均通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+參與的核內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及膜通透性轉(zhuǎn)換來(lái)控制細(xì)胞色素 C從線粒體中釋放，進(jìn)而阻滯或誘導(dǎo)凋亡，Bcl-2與 Bax的比值可以決定細(xì)胞是否凋亡[3，4]。Bax/Bcl-2升高則細(xì)胞凋亡，反之細(xì)胞存活的可能性增大。

Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用。Caspase-3被合成后通常以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在多種凋亡信號(hào)刺激下經(jīng)蛋白水解作用被激活，可對(duì)多種蛋白底物進(jìn)行降解，從而在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是 Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者之一，參與多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制 Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細(xì)胞凋亡受抑。當(dāng)接收到細(xì)胞凋亡信號(hào)的刺激，Bcl-2/Bax比值變小，使線粒體外膜通透性升高，引起細(xì)胞色素 C釋放到胞質(zhì)中，激活A(yù)paf-1，進(jìn)而活化 Caspase-3啟動(dòng)凋亡。

本研究顯示，與生理鹽水組比較，息賁膠囊治療組 Bax和 Caspase-3蛋白表達(dá)均上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2比值升高;息賁膠囊高劑量組及順鉑組與中、低劑量組比較各指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明息賁膠囊能下調(diào) Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào) Bax和 Caspase-3蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。至于息賁膠囊是否同時(shí)通過(guò)其他機(jī)制抑制肺癌組織的生長(zhǎng)，尚有待進(jìn)一步研究探討。

[1]杜忠海，孫長(zhǎng)崗，鄭華.息賁膠囊聯(lián)合 GP方案治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察[J].河北中醫(yī)，2006，28(10):728-730.

[2]杜忠海，牛術(shù)仙，鄭萍萍.息賁膠囊抗腫瘤生長(zhǎng)及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東中醫(yī)雜志，2007，26(9):632-633.

[3]張甘霖，王笑民，李萍，等.固本抑瘤Ⅱ號(hào)對(duì) Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(3):489-492.

[4]Lee JU，Hosotani R，Wada M，et al.Role of Bcl-2 family proteins(Bax，Bcl-2 and Bcl-x)on cellular susceptibility to radiation in pancreatic cancer cells[J].Eur J Cancer，1999，35(9):1374-1380.