董翠香，曲政海，韓征利，劉秀美，周 立

(1臨淄區(qū)人民醫(yī)院，山東臨淄 255400;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

支氣管哮喘目前尚無(wú)有效治療方法，吸入糖皮質(zhì)激素也僅僅是減輕氣道炎癥、延緩氣道重塑的對(duì)癥治療措施。2010年 4月 ～2010年 5月，我們以人參五味子湯和小青龍湯為基本方，探討中藥二步序貫治療對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 卵清白蛋白(OVA)(美國(guó) Sigma公司)，氫氧化鋁干粉(天津市天河化學(xué)試劑)，IL-4、INF-γELISA試劑盒(美國(guó) RD生物制藥公司)，布地奈德(瑞典阿斯利康公司)，人參五味子湯，小青龍湯。

1.2 方法

1.2.1 中藥制備 制備人參五味子湯汁方劑:人參8 g，白術(shù) 6 g，茯苓 10 g，炙甘草 3 g，麥冬 10 g，五味子 3 g;藥物經(jīng)冷水浸泡 30 min，陶器砂鍋武火煮沸后，文火煎 15 min，過(guò)濾，留取藥汁;藥渣加冷水煮沸后再熬 10 min，留取藥汁，2次藥汁約 100 ml，1 ml含生藥 0.40 g，裝入已消毒容器 4℃冰箱保存?zhèn)溆?。小青龍湯汁方?麻黃、赤芍、防風(fēng)各 9 g，細(xì)辛 3 g，甘草 4 g，半夏 8 g，五味子 3 g，桂枝 6 g;湯汁制備與人參五味子方法相同。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 健康雌性 SPF級(jí)昆明系小鼠 40只，4～5周齡，體質(zhì)量 16～18 g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘組、布地奈德組、二步序貫組，每組 10只。各組小鼠于 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng) 10 d。①致敏階段:哮喘組、布地奈德組、二步序貫組分別于 0、7、14 d行腹腔注射 OVA混懸液 0.2 ml，正常對(duì)照組以PBS液替代。期間二步序貫組每日予以人參五味子湯 0.4 ml胃飼(含生藥 0.160 g)，正常對(duì)照組予以生理鹽水 0.4 ml胃飼。②激發(fā)階段:在最后 1次腹腔注射結(jié)束后 1周，將各組小鼠分別放入 30 cm×40 cm×30 cm自制霧化箱內(nèi)，電動(dòng)空氣驅(qū)動(dòng)霧化1%OVA，每日 1次，每次 30 min，連續(xù) 9 d。正常對(duì)照組以 PBS替代。期間布地奈德組于激發(fā)前 20 min予以霧化布地奈德約 20 min;二步序貫組于激發(fā)前30 min分別予以小青龍湯 0.4 ml胃飼(含生藥0.204 g)。③病理檢查:最后一次霧化結(jié)束后 24 h內(nèi)處死小鼠，眼球取血;打開胸腔，觀察肺臟的大體改變，選取左側(cè)肺臟，經(jīng) 4%多聚甲醛固定液固定約24 h，脫水，石蠟包埋，制備厚 3μm的標(biāo)準(zhǔn)切片，待病理學(xué)檢查。

1.2.3 肺泡灌洗液 INF-γ、IL-4測(cè)定及氣道組織炎癥分級(jí) INF-γ、IL-4測(cè)定嚴(yán)格按 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各組的吸光度，并計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。氣道組織炎癥分級(jí)參照文獻(xiàn)[1]評(píng)定支氣管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，共分 0～4級(jí)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)差異比較用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體征變化 哮喘組、布地奈德組、二步序貫組小鼠激發(fā)吸入 1%OVA后出現(xiàn)抓耳撓腮、煩躁不安或俯伏不動(dòng)、屎尿多，有的出現(xiàn)呼吸加深加快的表現(xiàn)，哮喘組較其它各治療組癥狀均較明顯。正常對(duì)照組霧化 PBS未見上述表現(xiàn)。哮喘組小鼠霧化 3 d后出現(xiàn)皮毛無(wú)光澤現(xiàn)象，正常對(duì)照組未出現(xiàn)。

2.2 氣道組織的肉眼改變 正常對(duì)照組小鼠的氣道組織顏色呈粉紅色，其他組小鼠的氣道組織較正常對(duì)照組略蒼白，其中哮喘組較明顯，有的出現(xiàn)黑色斑點(diǎn)或紋理，有的體積有不同程度增大。

2.3 肺泡灌洗液 INF-γ、IL-4水平測(cè)定及小鼠肺部炎癥浸潤(rùn)程度 見表1。

表1 各組小鼠氣道炎癥及肺泡灌洗中 INF-γ、IL-4水平比較(±s)

表1 各組小鼠氣道炎癥及肺泡灌洗中 INF-γ、IL-4水平比較(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01，△P＜0.05

組別 n炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(級(jí))INF-γ(ng/L) IL-4(ng/L)正常對(duì)照組 10 0.8±0.42 527.01±23.21 152.02±5.93哮喘組 10 3.6±0.52* 272.71±13.71△ 232.85±5.42△布地奈德組 10 1.9±0.74* 374.81±19.63△ 162.44±7.79△二步序貫組 10 2.0±0.82* 510.63±29.16 167.89±4.77△

3 討論

研究表明，哮喘緩解期患兒存在 Th1/Th2調(diào)節(jié)失衡[2];進(jìn)一步研究表明哮喘發(fā)作期患兒血清中代表Th1功能的 INF-γ水平降低，代表Th2功能的 IL-4水平明顯升高[3];同樣在哮喘大鼠肺泡灌洗液、血漿及淋巴液均有 IL-4水平升高及 INF-γ水平的降低[4]。以上說(shuō)明，Th1/Th2失衡貫穿哮喘發(fā)病的始終，是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

哮喘在中醫(yī)上也分發(fā)作期與緩解期，哮喘證候發(fā)作期分寒哮、熱哮、風(fēng)哮和虛哮;緩解期為肺氣虧虛、脾氣虧虛和腎氣虧虛[5]。人參五味子湯出自清代名醫(yī)陳復(fù)正《幼幼集成》，具有益氣健脾、固衛(wèi)養(yǎng)肺之效，主治“久嗽脾虛、中氣怯弱、面白唇白”及“咳而久不止”等病癥。對(duì)人參五味子湯進(jìn)行現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，它不僅可以增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞的吞噬功能，誘生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，并有止咳、平喘、祛痰等對(duì)癥治療作用[6]。吳振起等[7]認(rèn)為人參五味子湯能明顯改善患兒免疫狀態(tài)，并增強(qiáng)患兒機(jī)體抗感染能力。小青龍湯出自張仲景《傷寒論》一書，是治療支氣管哮喘的有效經(jīng)典名方。從現(xiàn)代藥理學(xué)上講，小青龍湯不僅改善肺部炎癥、改善哮喘癥狀還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫失衡。張?jiān)谄涞萚8]發(fā)現(xiàn)小青龍湯可選擇性降低哮喘小鼠肺組織內(nèi)Th1/Th2數(shù)量，逆轉(zhuǎn)失衡的 Th1/Th2。張建國(guó)等[9]應(yīng)用小青龍口服液治療支氣管哮喘，臨床上收到良好的效果。

本結(jié)果顯示，布地奈德及二步序貫組在小鼠激發(fā)階段癥狀較輕，兩組間小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較無(wú)明顯差異，且較哮喘組明顯降低。各組肺泡灌洗液中 IL-4水平比較，哮喘組顯著升高;各組肺泡灌洗液中 INF-γ水平比較，發(fā)現(xiàn)各治療組均較哮喘組顯著升高外，二步序貫組同正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示二步序貫治療在調(diào)節(jié) INF-γ水平有其獨(dú)特之處。二步序貫治療可通過(guò)調(diào)節(jié) Th1/Th2失衡有效地改善氣道炎癥，治療效果與吸入布地奈德相似，此為今后哮喘中藥序貫治療提供了理論基礎(chǔ)。

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