楊 芳，韓玉翠

(1安康學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)院，陜西安康 725000;安康市中心醫(yī)院)

為探討酒精性脂肪肝(AFL)的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程，評(píng)判藥物療效，建立可重復(fù)、簡(jiǎn)單易行且穩(wěn)定的 AFL動(dòng)物模型十分重要。2009年 7～12月，我們通過(guò)比較兩種大鼠酒精性脂肪肝模型，以探索穩(wěn)定可靠的 AFL大鼠建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性 SD大鼠 40只(180～200 g)，購(gòu)自西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。無(wú)水乙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒購(gòu)于上?？迫A生物工程股份有限公司，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(γ-GT)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法 ①模型制備及動(dòng)物分組:40只大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)、飲用乙醇組(10只)和乙醇灌胃組(20只)。正常組大鼠自由飲水;飲用乙醇組參照文獻(xiàn)[1]報(bào)道:大鼠自由飲用乙醇飲料(每 100 ml水中溶解 15 g白糖)，其乙醇濃度從 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，并且在 40%時(shí)，持續(xù) 4周;乙醇灌胃組參照文獻(xiàn)[2]報(bào)道并加以改進(jìn)，大鼠給予 40%乙醇灌胃，乙醇 8 g/(kg?d)分 2次灌胃，2次間隔 9～10 h，灌胃至 6周末;自 7周開(kāi)始，將乙醇濃度增至 50%，乙醇 9 g/(kg?d)，同前分 2次灌胃，至 12周末。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，3組大鼠均為自由采食，分籠飼養(yǎng)，每籠 4只，在室溫及穩(wěn)定濕度條件下，全價(jià)顆粒飼料(由動(dòng)物中心提供)喂養(yǎng)，其持續(xù)時(shí)間為 12周。②標(biāo)本處理:實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠一般情況，心臟無(wú)菌采血，制備血清，立即用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè) ALT、AST、γ-GT。肝臟稱質(zhì)量后作大體觀察，計(jì)算肝指數(shù)(肝臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量 ×100[3])。制作切切片、染色，光鏡下觀察肝臟組織形態(tài)及肝臟脂肪變性程度。含脂肪滴肝細(xì)胞所占面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:無(wú)脂肪變性為 0分;脂肪變性在肝小葉 ＜1/3為 1分;脂肪變性在肝小葉 1/3～1/2為 2分;脂肪變性在肝小葉 ＞1/2～2/3為 3分;脂肪變性在肝小葉 ＞2/3為 4分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用 SNK法;計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)或確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 12周末對(duì)照組、飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠體質(zhì)量分別為(506±48)、(420±33)、(415±31)g;飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。飲用乙醇組大鼠發(fā)生胃腸脹氣 3只，發(fā)生率為 30%;乙醇灌胃組發(fā)生胃腸脹氣 17只，發(fā)生率為 85%;兩組胃腸脹氣發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 三組大鼠肝功能指標(biāo)比較 12周后飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠 AST、γ-GT水平、AST/ALT與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＜0.05)。12周后飲用乙醇組大鼠 ALT與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乙醇灌胃組大鼠 ALT與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠 12周末肝功能檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1 三組大鼠 12周末肝功能檢測(cè)結(jié)果(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

正常對(duì)照組 10 47.43±3.69 91.29±7.27 1.45±0.67 1.92±0.04飲用乙醇組 10 77.71±10.06*188.57±33.65*4.76±0.88*2.42±0.24*乙醇灌胃組 20 51.00±5.48 197.00±35.98*5.13±0.90*3.84±0.35*

2.3 三組大鼠肝臟大體標(biāo)本觀察指標(biāo)比較 12周后飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量差、肝質(zhì)量與體質(zhì)量差比率、肝指數(shù)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 ＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠大體標(biāo)本觀察指標(biāo)比較(±s)

表2 三組大鼠大體標(biāo)本觀察指標(biāo)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

正常對(duì)照組 10 245.14±31.71 11.40±0.89 0.05±0.008 2.51±0.29飲用乙醇組 10 175.73±36.92** 11.86±1.06 0.07±0.017*2.94±0.36*乙醇灌胃組 10 158.50±22.77** 12.25±0.92 0.07±0.011*2.96±0.32*

2.4 肝臟組織病理觀察 光鏡下，模型組肝細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)大小不等圓形脂滴空泡，伴有局部炎癥和壞死。依脂變范圍，三組大鼠 12周脂肪變程度積分分別為(0.00±0.000)、(2.33±0.817)、(2.33±0.516)分，飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠肝臟脂肪變程度積分與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，AFL動(dòng)物模型有在飲水中加入乙醇的模型、Liber-Decarli液體食料和液體食料加輔劑模型[4，5]、Tsukamato French大鼠模型[6，7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者應(yīng)用最多是乙醇灌胃來(lái)建立酒精性肝病模型，他們?cè)谖癸暪腆w飼料的同時(shí)，每日給大鼠灌胃一定量的乙醇，但這種方法繁瑣，易引起因插管灌胃相關(guān)的并發(fā)癥，甚至造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。飲水中加入乙醇是生理方式喂食乙醇的方法，符合人類正常的乙醇攝入途徑。通過(guò)添加蔗糖克服了大鼠厭乙醇的缺點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn) 12周末飲用乙醇組大鼠禁食禁飲后死亡1只、死亡率為 10%，乙醇灌胃組大鼠死亡 9只、死亡率為 45%，12周后飲用乙醇組與乙醇灌胃組大鼠AST活性、γ-GT含量、肝指數(shù)與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且肝組織出現(xiàn)大量脂肪變性，伴有局部炎癥和壞死;飲用乙醇組與乙醇灌胃組 ALT、AST、γ-GT、肝指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明乙醇對(duì)模型大鼠肝臟均造成一定程度的損傷。

本次實(shí)驗(yàn)中飲用乙醇組、乙醇灌胃組大鼠處死后解剖發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠不同程度的伴有胃腸脹氣。胃腸脹氣產(chǎn)生的可能原因是:①大鼠肝臟功能衰退，消化吸收障礙使食物被上段消化道內(nèi)大量的細(xì)菌分解，產(chǎn)生大量氣體。而胃腸運(yùn)動(dòng)和血液循環(huán)障礙造成氣體在腸腔聚積，形成胃腸脹氣。②大鼠灌胃操作容易導(dǎo)致消化道黏膜的損傷，細(xì)菌繁殖，同時(shí)由于單次灌胃操作不能保證每次每只大鼠使用一支灌胃針，不可避免反復(fù)使用灌胃器操作，導(dǎo)致大鼠之間交叉感染。近端小腸內(nèi)大量的細(xì)菌繁殖是肝衰竭時(shí)腹脹、腸脹氣、中毒性鼓腸的主要原因之一。胃腸功能不全反過(guò)來(lái)可影響肝損傷的修復(fù)，甚至加重肝臟的損傷過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示，兩種大鼠乙醇肝建模效果一致。生理方式喂食乙醇建立大鼠 AFL模型與人類AFL發(fā)生發(fā)展整個(gè)過(guò)程相似，具有很強(qiáng)的模仿性，并且此造模方法簡(jiǎn)單易行，一般實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行，更值得被推廣。

[1]王曉紅，曹琦，李俊，等.改良法大鼠酒精性脂肪肝模型的建立[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(4):420-423.

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