陳 蘭，呂小平*，詹靈凌，唐星火

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院，南寧 530021，2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)部)

炎癥性腸病(IBD)是一組病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，常見類型為潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。國外文獻(xiàn)證實(shí)，ATG16L1基因 SNP多態(tài)性位點(diǎn) rs2241880為白種人 CD發(fā)病的易感基因之一[1，2];我國智佳等[3]報(bào)道自噬體基因 ATG16L1多態(tài)性與 IBD無明顯相關(guān)性。為此，我們對廣西壯族 IBD患者基因多態(tài)性與 IBD的關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2007年 2月 ～2010年 10月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的廣西無親緣關(guān)系的 IBD患者 146例(病例組)，男 74例、女 72例，年齡(38±11)歲;其中 UC 86例，CD 60例;UC及CD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會 2007年對 IBD診斷治療規(guī)范的建議，并排除合并其他自身免疫性疾病。UC患者中病變部位位于直腸 45例，左半結(jié)腸 21例，右半結(jié)腸 12例，全結(jié)腸 8例;CD患者中病變部位位于小腸 32例，結(jié)腸 16例，小腸合并結(jié)腸 7例，直腸 5例。146例 IBD中，壯族 70例，漢族 76例。另取廣西無親緣關(guān)系的正常對照組 164例，男 81例、女 83例 ，年齡(42±9)歲;其中壯族 80例，漢族 84例。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 ①基因組 DNA提取:收集兩組腸黏膜組織(30～50 mg)，保存于液氮罐中。將新鮮標(biāo)本用生理鹽水清洗干凈、剪碎，加入 450μl TES、50μl SDS(10%)和 5μl蛋白酶 K(20 mg/ml)，混勻后放在 65℃水浴中 4～6 h;加入等體積苯酚，混勻后在 4℃、12 000 r/min離心 10 min。提取上清液于另一試管，加入等體積酚、氯仿、異戊醇(25∶24∶1)，混勻后在 4℃、12 000 r/min離心10 min。提取上清液于另一試管，加入等體積氯仿、異戊醇(24∶1)，混勻后在 4℃、12 000 r/min離心10 min。提取上清液，加入 99%乙醇反復(fù)抽吸后出現(xiàn)白色絮狀物，在 4℃、12 000 r/min離心 10 min，去掉上清液;在白色絮狀物中加入 75%乙醇混勻，在 4℃、12 000r/min離心 5 min，去掉上清液，加入 50～100μl TE溶解，-20℃保存。②引物序列:包含 rs2241880位點(diǎn)的擴(kuò)增長度為 193 bp，上游引物為 5'-ATTTGATGAGCAGTAAACCTCTG-3';下游引物為 5'-GGGGCTGAAGCATACTTACG-3'，特異性引物擴(kuò)增ATG16L1基因的目的基因片段。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。③PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)總體積為 25μl，其中包含 2×PCR緩沖液 11.5μl、去離子水10.5μl、DNA 1μl、10 μmol/L上下游引物各 1 μl。95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性 40 s，58℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，共 28次循環(huán) ，最后 72℃徹底延伸10 min。PCR產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并在紫外分析儀下分析鑒定，觀察電泳結(jié)果。④PCR產(chǎn)物核苷酸序列測定:將 PCR產(chǎn)物切膠純化，采用切膠純化試劑盒將目的片段純化回收，分光光度計(jì)檢測純化產(chǎn)物濃度，并將純化后的 PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序儀為美國SIB3730XL測序儀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS16.0軟件包，根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，各組的基因型比較采用 χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1、2。

圖1 壯族人PCR擴(kuò)增目的基因片段的凝膠電泳圖

圖2 漢族人 PCR擴(kuò)增目的基因片段的凝膠電泳圖

2.2 PCR產(chǎn)物核苷酸序列測定 測序圖顯示ATG16L1基因第 9外顯子第 47位等位基因位點(diǎn)為等位基因多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)由蘇氨酸突變?yōu)楸彼?ACT變?yōu)?GCT)，純合突變(GG)為黑色單峰，純合未突變(AA)為綠色單峰，雜合突變?yōu)楹?、綠色雙峰。

2.3 ATG16L1基因測序結(jié)果 ①壯族病例組與其對照組比較:兩組樣本遺傳平衡檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明樣本具有代表性。壯族病例組與對照組 ATG16L1基因型及等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＞0.05)，見表1。②漢族病例組與其對照組比較:兩組樣本遺傳平衡檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明樣本具有代表性。漢族病例組與對照組 ATG16L1基因型及等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均 ＞0.05)，見表2。

表1 壯族病例組與對照組ATG 16L1基因型及等位基因頻率分布

表2 漢族病例組與對照組ATG 16L1基因型及等位基因頻率分布

3 討論

ATG16L1基因主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，其編碼的 ATG16L1蛋白與自噬蛋白ATG5和 ATG12形成復(fù)合物，在處理細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染時(shí)發(fā)揮重要作用;Rioux等[4]證實(shí)敲除 ATG16L1基因會降低 HeLa細(xì)胞對沙門氏菌的吞噬作用。Cadwell等[5]報(bào)道了 ATG16L1在 Paneth細(xì)胞中的獨(dú)特作用。Paneth細(xì)胞是小腸內(nèi)的一種上皮細(xì)胞，分泌 ATG16L1蛋白，含有抗菌肽和溶菌酶顆粒;異常Paneth細(xì)胞分泌顆粒缺乏，導(dǎo)致清除微生物的能力下降。ATG16L1缺陷會阻斷 ATG12-ATG5結(jié)合到細(xì)胞膜，從而影響微管連接蛋白 1輕鏈 3結(jié)合到磷脂酰乙醇胺，最后影響自噬體形成，導(dǎo)致自噬過程障礙及一系列病原體清除能力下降[6]。另外，在缺乏ATG16L1表達(dá)的巨噬細(xì)胞中由細(xì)菌內(nèi)毒素刺激下會產(chǎn)生大量炎癥因子，如 IL-1和 IL-18。

IBD基因易感性涉及多個(gè)位點(diǎn)，且有著種族差異性。Hampe等[7]研究發(fā)現(xiàn)，通過全基因組掃描及回歸分析篩選出與 CD相關(guān)的 ATG16L1基因 SNP位點(diǎn) rs2241880，并通過大樣本實(shí)驗(yàn)證實(shí)歐洲人此位點(diǎn)的多態(tài)性與 CD易感性相關(guān)，與 UC無關(guān)，且此突變位點(diǎn)導(dǎo)致 CD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與 CARD15顯著相關(guān)。目前該位點(diǎn)與 CD的關(guān)系已在新西蘭、德國、荷蘭、匈牙利、美國、英國人群中得到反復(fù)驗(yàn)證;且在英國[8]此位點(diǎn)只與成人 IBD有關(guān)，與兒童 IBD無關(guān);而在澳大利亞[9]人群中的研究顯示 ATG16L1基因SNP位點(diǎn) rs2241880與回腸型 CD相關(guān)，同時(shí)首次報(bào)道與 UC的發(fā)生顯著相關(guān)。另外，在部分匈牙利人群[10]及德國人群[11]研究中均發(fā)現(xiàn) ATG16L1與CARD15之間未明顯增加 CD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而是獨(dú)立存在的危險(xiǎn)因素。然而在亞洲國家報(bào)道中，IBD患者的 ATG16L1基因位點(diǎn) rs2241880的多態(tài)性與CD易感性無關(guān)[12，13]。由此我們認(rèn)為，可能ATG16L1基因的多態(tài)性隨種族和區(qū)域的不同而異。

本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)廣西壯族 IBD患者中 ATG16L1基因位點(diǎn)rs2241880的多態(tài)性與 CD、UC相關(guān)，這與中國其他省份研究結(jié)果一致，據(jù)此推測 ATG16L1基因SNP位點(diǎn)rs2241880可能與我國 IBD無關(guān)。在其他國家和地區(qū)報(bào)道 ATG16L1基因 SNP位點(diǎn) rs2241880與IBD患者有相關(guān)性，可能是由于種族和地理位置的差異性所致。

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