喻文立，崔乃強(qiáng)，傅 強(qiáng)，李東華

腹腔感染可以引起腸道屏障功能障礙，產(chǎn)生持續(xù)的腸源性內(nèi)毒素血癥，誘導(dǎo)全身過度、失控的炎癥反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致膿毒癥或多器官功能障礙綜合征。感染導(dǎo)致膿毒癥時機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的同時伴有抗炎癥反應(yīng)，早期以炎癥反應(yīng)為主，晚期以抗炎反應(yīng)為主，經(jīng)歷一個免疫抑制階段。Thl和Th2細(xì)胞功能的改變能夠反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，而Treg作為免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞之一，可能與膿毒癥早期細(xì)胞免疫抑制有關(guān)[1]。由于中藥因其免疫調(diào)理功能在膿毒癥的防治中展現(xiàn)了良好的療效[2]，本研究以大鼠腹腔感染模型為研究對象，探討清熱解毒方劑對機(jī)體免疫失衡狀態(tài)的影響及作用機(jī)理，為膿毒癥的臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性健康Wistar大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院四所動物室提供，動物號為DD20013）120只，體質(zhì)量200～220g，在實驗室使用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)1周。

1.2 大腸桿菌 菌株來自臨床腹膜炎病人，經(jīng)全自動微生物分析系統(tǒng)（VITEK-AMS）鑒定為大腸桿菌（E.Coli）。將E.Coli接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18 h，生理鹽水沖洗菌苔，應(yīng)用比濁法測定E.Coli濃度，配制濃度為2×109cfu/mL的細(xì)菌懸濁液。

1.3 人工胃液 取濃度為10.5%鹽酸16.4mL，加生理鹽水約800mL與胃蛋白酶10g，搖勻后，加生理鹽水稀釋成1000mL，測量pH值約為1.5。

1.4 中藥方劑與制備 清熱解毒方劑，由大黃、黃芩、白頭翁、敗醬草組成，藥物劑量配比為2∶2∶3∶3，由天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥研室提供，制備成含生藥量1 g/mL的濃度縮煎劑，分裝，高壓滅菌后置于4℃冰箱存放備用。

1.5 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（Becton Dickson公司，美國）。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記小鼠抗大鼠CD4單克隆抗體（Becton Dickson公司，美國），藻紅霉素（PE）標(biāo)記小鼠抗大鼠干擾素-γ（IFN-γ）單克隆抗體（Becton Dickson公司，美國），PE標(biāo)記小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素-4單克隆抗體（Becton Dickson公司，美國），PE標(biāo)記小鼠IgG1κ同型對照抗體（Becton Dickson公司，美國），F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗大鼠CD4單克隆抗體（Biolegend公司，美國），F(xiàn)ITC標(biāo)記小鼠抗大鼠CD25單克隆抗體（Biolegend公司，美國），別藻藍(lán)素（APC）標(biāo)記小鼠抗大鼠叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）單克隆抗體（eBioscience公司，美國）。

1.6 腹腔感染模型建立和分組 參照文獻(xiàn)[3]介紹的方法，無菌條件下，取2mL人工胃液于大鼠左下腹注入腹腔，2 h后分別取菌液按照1mL/100g體質(zhì)量，10%BaSO4牛肉湯1mL，左下腹腹腔內(nèi)注射，制成腹膜炎模型。正常對照組腹腔內(nèi)注入等量生理鹽水。120只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、清熱解毒方劑組，每組40只。各組分別于造模后12 h、24 h、48 h、72 h隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后解剖腹腔，無菌留取腹主動脈血1mL待測。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1 全血Th1/Th2比值 腹主動脈血加入刺激劑（PMA、離子霉素、BFA）混合，孵育4 h。取出混勻后，將血樣加入3只試管中，分別加入FITC標(biāo)記小鼠抗大鼠CD4抗體進(jìn)行細(xì)胞外染色，經(jīng)過溶血和破膜通透，將PE標(biāo)記的小鼠 IgG1抗體（同型對照）、小鼠抗大鼠IFN-γ抗體和IL-4抗體分別加入3只試管中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。在CD4-FITC/SSC圖中設(shè)門，選出CD4+T細(xì)胞群，在CD4-FITC/IgG1-PE設(shè)定陰性區(qū)域，在CD4-FITC/IFN-γ-PE和CD4-FITC/IL-4-PE圖中計算IFN-γ＋細(xì)胞和IL-4＋細(xì)胞各占CD4+T細(xì)胞的比例，以二者之比表示Th1/Th2比值。

1.7.2 全血Treg比例 肝素抗凝全血加入2只試管，每管加入FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD4和CD25抗體進(jìn)行細(xì)胞外染色，破膜通透后分別加入APC標(biāo)記的大鼠 IgG2b抗體（同型對照）和小鼠抗大鼠Foxp3抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。在FSC/SSC圖中設(shè)門，選出淋巴細(xì)胞群，在CD4-FITC/CD25-PE圖中，運用十字象限確定CD4+、CD25+細(xì)胞。在CD4-FITC/IgG2a-APC圖中，設(shè)定陰性區(qū)域，在CD4-FITC/Foxp3-APC圖中，確定Foxp3+細(xì)胞比例，計算CD4+、CD25+、Foxp3+細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例作為Treg比例。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析。Th1/Th2比值與Treg比例采用Sigmaplot 9.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后全血Th1/Th2比值 與對照組比較，模型組Th1/Th2比值在造模后12 h顯著升高（P＜0.01），清熱解毒方劑組Th1/Th2比值升高幅度低于模型組；與對照組比較，造模后24 h模型組和清熱解毒方劑組Th1/Th2比值升高（P＜0.01），兩組之間比較差異無顯著性；造模后48 h，3組Th1/Th2比值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后72 h，模型組Th1/Th2比值與對照組比較明顯降低（P＜0.01），而清熱解毒方劑組與對照組比較未見顯著差異（詳見表1）。

2.2 造模后全血Treg比例 造模后12 h，模型組與清熱解毒方劑組Treg比例與對照組比較均顯著降低（P＜0.01），兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；造模后24 h，模型組與清熱解毒方劑組Treg比例仍低于對照組（P＜0.05或P＜0.01），但清熱解毒方劑組與模型組比較顯著降低（P＜0.01）；造模后48 h和72 h，模型組Treg比例顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），而清熱解毒方劑組與對照組比較無顯著差異（詳見表2）。

表1 各組大鼠各時點全血Th1/Th2比值比較（n=10，）

表1 各組大鼠各時點全血Th1/Th2比值比較（n=10，）

注:與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

?

表2 各組大鼠各時點全血Treg比例比較（n=10，）

表2 各組大鼠各時點全血Treg比例比較（n=10，）

注:與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

?

2.3 Th1/Th2比值與Treg比例相關(guān)性分析 模型組Th1/Th2比值與Treg比例呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.867，P＜0.05），如圖1。清熱解毒方劑組Th1/Th2比值與Treg比例呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.914，P＜0.05），如圖2。

圖1 模型組大鼠各時間點全血Treg比例與Th1/Th2比值線性相關(guān)分析

圖2 清熱解毒方組大鼠各時間點全血Treg比例與Th1/Th2比值線性相關(guān)分析

3 討論

本實驗在既往研究基礎(chǔ)上，于注射大腸桿菌之前向腹腔內(nèi)注射人工胃液，模擬臨床上消化道穿孔病理過程，通過反復(fù)摸索，復(fù)制成功大鼠腹腔感染模型[3]。腹腔感染可以通過多種因素造成腸屏障功能損害，引起腸源性內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致膿毒癥的產(chǎn)生[4]。T輔助淋巴細(xì)胞，特別是Thl和Th2細(xì)胞功能的改變能夠反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，Th1和Th2細(xì)胞可通過所產(chǎn)生的細(xì)胞因子發(fā)揮相互調(diào)節(jié)和相互制約作用，Th1/Th2的平衡變化有助于反映SIRS/CARS的失衡[5]。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Thl/Th2比值在造模后12 h上升并達(dá)到峰值，從24 h到72 h呈持續(xù)下降的趨勢。感染、創(chuàng)傷等導(dǎo)致膿毒癥時，機(jī)體炎癥反應(yīng)的同時伴有抗炎癥反應(yīng)發(fā)生，且早期以炎癥反應(yīng)為主，晚期以抗炎反應(yīng)為主，隨著時間延長，出現(xiàn)Th1向Th2漂移，本實驗結(jié)果驗證了這一結(jié)論。清熱解毒方劑組Thl/Th2比值變化趨勢與模型組一致，但是Thl/Th2升高和降低的幅度小于模型組，說明以大黃、黃芩、白頭翁及敗醬草為組方的清熱解毒方劑可以增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，在腹腔感染早期明顯降低促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)程度，在膿毒癥進(jìn)展過程中維持Thl細(xì)胞功能，抑制Th1向Th2漂移，使抗炎與促炎反應(yīng)趨向平衡。

Treg作為免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞之一，在膿毒癥免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著對細(xì)胞免疫的抑制作用，近年來在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究中受到越來越多的關(guān)注。CD4+、CD25+、Treg是研究較為深入的天然Treg，F(xiàn)oxp3的表達(dá)對Treg細(xì)胞來說是高特異性的，因此本實驗以CD4+、CD25+、Foxp3+T細(xì)胞來準(zhǔn)確地代表Treg。Treg發(fā)揮免疫效應(yīng)依賴于它與效應(yīng)性T細(xì)胞（CD4+、CD25－T細(xì)胞）的相對數(shù)量的變化，即Treg占CD4+T細(xì)胞比例的變化，Treg的增減決定著Th1/Th2作用主次關(guān)系的轉(zhuǎn)換，同時決定著炎癥反應(yīng)的發(fā)展方向[6]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組Treg比例在造模后12 h明顯減少，但造模后24 h、48 h和72 h明顯升高，Treg比例的變化與Th1/Th2比值的變化呈明顯負(fù)相關(guān)，說明膿毒癥早期機(jī)體發(fā)生Treg比例的升高，導(dǎo)致細(xì)胞免疫的抑制，表現(xiàn)為Th1/Th2比值的降低。Treg比例增高可能有兩方面原因:（1）腸源性內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致循環(huán)中CD4+T細(xì)胞發(fā)生凋亡，Treg對凋亡的抵抗力明顯強(qiáng)于CD4+、CD25－T細(xì)胞，導(dǎo)致相對比例的增加[7]；（2）Treg表面具有廣泛的Toll樣受體，細(xì)胞因子、細(xì)菌及內(nèi)毒素的刺激在體內(nèi)外均可通過Toll樣受體促進(jìn)Treg增殖及存活，并增強(qiáng)其功能，因此移位的腸源性內(nèi)毒素可以導(dǎo)致循環(huán)中Treg比例和活性增加，介導(dǎo)了Th1向Th2的漂移[8]。清熱解毒方劑組Treg比例的變化與Th1/Th2比值的變化也呈明顯負(fù)相關(guān)，而Treg比例的升高幅度顯著低于模型組，說明清熱解毒方劑可能通過降低Treg來起到免疫調(diào)節(jié)的作用，抑制了Th1向Th2的漂移。

腹腔感染狀態(tài)下，機(jī)體細(xì)胞免疫功能抑制，表現(xiàn)為Th1/Th2比值減少，即Th1向Th2的漂移，其機(jī)制與腸源性內(nèi)毒素介導(dǎo)Treg比例和活性增加有關(guān)，清熱解毒方劑可通過調(diào)節(jié)Treg比例影響Th1/Th2比值，起到免疫調(diào)理作用。

[1]姚詠明.免疫功能紊亂在膿毒癥發(fā)病中的作用及意義[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2007，19(3):138.

[2]崔乃強(qiáng)，傅強(qiáng)，邱奇，等.通里攻下法對SIRS/MODS的治療價值-多中心臨床分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2007，13(1):3.

[3]喻文立，崔乃強(qiáng)，劉洪斌，等.清熱解毒方劑對腹腔感染大鼠腸黏膜屏障功能的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2009，15(3):305.

[4]喻文立，崔乃強(qiáng)，杜洪印，等.膿毒癥大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞免疫功能的變化 [J].中華麻醉學(xué)雜志，2009，29(10):923.

[5]Abbas AK，Murphy KM，Sher A.Functional diversity of helper T lymphocytes[J].Nature，1996，383(3):787.

[6]Wisnoski N，Chung CS，Chen Y，et al.The contribution of CD4+CD25+T-regulatory-cells to immune suppression in sepsis[J].Shock，2007，27(5):251.

[7]Venet F，Pachot A，Debard AL，et al.Increased percentage of CD4+CD25+regulatory T cells during septic shock is due to the decrease of CD4+CD25-lymphocytes[J].Crit Care Med，2004，32(5):2329.

[8]Sutmuller RPM，Morgan ME，Neteamg，et al.Toll-like receptors on regulatory T cells:expanding immune regulation[J].Trends Immunol，2006，27(2):387.