梁靚靚，陳蘇寧，王曉鳳，蔡玉文

調(diào)氣消積湯對Lewis肺腫瘤小鼠抑瘤作用及細胞凋亡影響的實驗研究*

梁靚靚1，陳蘇寧1，王曉鳳1，蔡玉文2

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110004；2.遼寧中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，沈陽 110032）

[目的]探討調(diào)氣消積湯對Lewis肺腫瘤的抑瘤作用及細胞凋亡的影響。[方法]C57BL/6小鼠常規(guī)接種Lewis肺腫瘤，隨機分為：荷瘤對照組（MG）、調(diào)氣消積湯組（TG）、順鉑組（DG）、綜合組（ZG），每組10只。每天分別予飲用水、調(diào)氣消積湯各0.4mL灌胃，共12 d；隔日1次腹腔注射生理鹽水、順鉑0.13mL共3 d。觀察其日常生活狀況和腫瘤生長情況，應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL）檢測調(diào)氣消積湯對Lewis肺腫瘤細胞凋亡的影響。[結(jié)果]調(diào)氣消積湯能改善Lewis肺腫瘤小鼠一般狀況，與荷瘤對照組比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各治療組的瘤質(zhì)量均低于荷瘤對照組，差異顯著（P<0.01）。光鏡下觀察，各治療組與荷瘤對照組比較，異型細胞較少，染色質(zhì)濃縮邊集，病理性核分裂較少。TUNEL法結(jié)果顯示，各治療組與荷瘤對照組相比凋亡細胞明顯增多，綠色熒光強度高；尤以綜合組增多最為明顯。[結(jié)論]調(diào)氣消積湯可以改善荷瘤小鼠的一般生活狀況，對Lewis肺腫瘤有抑制作用，能促進腫瘤細胞凋亡。

調(diào)氣消積湯；Lewis肺腫瘤；細胞凋亡

調(diào)氣消積湯是在小柴胡湯原方基礎(chǔ)上加味而來的臨床治療肺腫瘤的有效方劑。本實驗通過觀察各組荷瘤小鼠的一般狀態(tài)、腫瘤的生長情況、腫瘤組織在光鏡下結(jié)構(gòu)的改變以及細胞凋亡的情況，來探討調(diào)氣消積湯的抑癌作用及其機制，并客觀地評價其抗腫瘤效應(yīng)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 1）調(diào)氣消積湯由柴胡10 g，黃芩15 g，人參 10 g，半夏 15 g，炙甘草 10 g，生姜 10 g，大棗 4 枚（10g），天門冬 15g，生牡蠣 30g，莪術(shù) 15 g，白花蛇舌草20 g等組成。購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥局，按照中藥常規(guī)煎法煎成相當于生藥1×10-3g/mL，4℃冰箱保存，用前稀釋至所需濃度。2）注射用順鉑（DDP），每支 10mg，齊魯制藥(海南)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20073652。每日給藥前用蒸餾水配制成1 g/L藥液。

1.2 實驗動物與瘤株 近交系C57BL/6J小鼠50只，鼠齡 10周，體質(zhì)量（20±2）g，均為雌性，動物級別：清潔級，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，許可證編號：SC XK（京）2004-0001。Lewis肺腫瘤細胞株，由中國醫(yī)科大學免疫實驗室提供。

1.3 實驗試劑 錐蟲藍染色液，20%烏拉坦注射液，4%多聚甲醛溶液，0.08%多聚賴氨酸（Sigm a公司），原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）等。

1.4 實驗儀器 高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司，TG-W S）；小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司，ZZ－6）；包埋機（EG 1150H）、手動石蠟切片機（RM 2235）、攤片機（HI 1150）、烘片機（HI 1220）、智能化組織脫水機（LEICA ASP 300）（德國萊卡公司）。

2 實驗方法

2.1 造模[1]-100℃液氮保存的Lewis瘤株，于37℃水浴中復(fù)蘇，然后接種于C57BL/6小鼠腹腔；9 d后，無菌條件下操作，取荷瘤小鼠腹水，經(jīng)生理鹽水洗滌后，調(diào)整細胞濃度至約2×109個/L的瘤細胞懸液，臺盼藍染色觀察記錄活細胞數(shù)（＞95%）；在每只小鼠右腋窩皮下接種瘤細胞0.2mL，共接種48只。

2.2 分組及給藥 接種5 d后，待移植瘤長至直徑0.3～0.5 cm時，選取荷瘤成功的小鼠40只，按照隨機數(shù)字表法隨機分為荷瘤對照組（MG）、調(diào)氣消積湯組（TG）、順鉑組（DG）、綜合組（調(diào)氣消積湯＋順鉑組）（ZG），每組10只。各組均在接種5 d后晨起空腹開始給藥。根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式[2]：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3，計算出給藥量。

1）灌胃每日1次，連續(xù)12 d。TG組和ZG組分別予相當于含生藥16.5g/（kg·d）的調(diào)氣消積湯0.4mL；MG、DG組分別予飲用水0.4mL。

2）腹腔注射隔日1次，共3 d。DG和ZG組予順鉑注射液0.13mL；MG、TG組分別予生理鹽水0.13mL。

2.3 實驗觀察指標

2.3.1 Lewis肺腫瘤小鼠生活狀況的評價 分別在實驗的第1、4、7、12天記錄各組小鼠體質(zhì)量及平均進食量，觀察小鼠一般狀態(tài)。實驗結(jié)束前用ZZ-6型小鼠自主活動測試儀，檢測各組小鼠在5min內(nèi)的自主活動次數(shù)和站立次數(shù)。

2.3.2 Lewis肺腫瘤移植瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率的比較 在電子天平上稱取瘤質(zhì)量。療效評價公式：抑瘤率＝（模型組平均瘤質(zhì)量－實驗組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.3.3 Lewis肺腫瘤組織的病理形態(tài)學觀察 采用蘇木精—伊紅（HE）染色法。石蠟組織塊制作：取材和固定，修塊，沖洗，脫水，透明，浸蠟，包埋。石蠟切片制作：修切蠟塊，防脫片處理，切片，展片，撈片。HE染色：脫蠟，復(fù)水，染色，脫水，透明，封藏，用顯微鏡觀察染色結(jié)果：細胞核呈鮮艷的藍色，細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)呈粉紅至紅色。

2.3.4 TUNEL法檢測Lewis肺癌細胞凋亡 常規(guī)制作腫瘤組織石蠟切片。脫蠟及水合，加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)30min。每個預(yù)處理好的樣本滴加50μL脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移（TdT）酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60min（陰性對照不加TdT酶）。用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析（One－Way ANOVA），方差齊時選用LSD法，方差不齊時選Dunnett’s T3療法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 調(diào)氣消積湯對Lewis肺腫瘤小鼠生活狀況的影響 實驗第10天，在實驗條件均一，無人為操作失誤的情況下，順鉑組有1只小鼠死亡，其余各組無死亡小鼠。實驗過程中，各組小鼠一般生活狀況及進食量詳見表1。實驗結(jié)束前，記錄各組小鼠在5min內(nèi)的自主活動次數(shù)和站立次數(shù)，其中調(diào)氣消積湯組明顯高于荷瘤對照組、順鉑組、綜合組（P＜0.05，P＜0.01）。順鉑組基本喪失站立能力，表現(xiàn)最差。見圖1。

表1 各組一般狀況的比較（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

表1 各組一般狀況的比較（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，*P＜0.05。

數(shù)量 反應(yīng)性 體毛 大便 平均進食量（g）荷瘤對照組 0 遲鈍 干枯，無光澤 變軟 2.03±0.75調(diào)氣消積湯組 0 較靈敏 柔順，有光澤 成形 2.85±0.28*順鉑組 1 非常遲鈍 稀疏脫落，無光澤 溏便 1.10±0.22*綜合組 0 遲鈍 少量脫落，無光澤 稀糊狀 1.37±0.36組別 死亡

3.2 調(diào)氣消積湯對Lewis肺腫瘤移植瘤質(zhì)量的影響 見表2。

由表2可以看出，各治療組的瘤質(zhì)量均低于荷瘤對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明調(diào)氣消積湯具有抑制腫瘤生長的作用；其中綜合組的抑瘤作用最強，抑瘤率為75.19%，順鉑組的抑瘤率為71.23%，調(diào)氣消積湯組的抑瘤率為29.37%。

表2 各實驗組瘤質(zhì)量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

表2 各實驗組瘤質(zhì)量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

注：與荷瘤對照組比較，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)量（n） 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）始 末荷瘤對照組 10 10 1.161±0.156 -調(diào)氣消積湯組 10 10 0.820±0.116** 29.37順鉑組 10 9 0.334±0.089** 71.23綜合組 10 10 0.288±0.076** 75.19

3.3 調(diào)氣消積湯對Lewis肺癌組織病理形態(tài)學改變的影響 荷瘤對照組：肉眼可見腫瘤體積較大，形態(tài)不規(guī)則，質(zhì)脆易破，切開后極少見腫瘤組織壞死。低倍鏡下可見荷瘤對照組腫瘤細胞呈巢狀分布且生長旺盛，細胞密集排列。高倍鏡下可見腫瘤細胞密集排列，細胞大小不一，形狀不規(guī)則，細胞核肥大、畸形，染色深，核染色分布不均勻，病理性核分裂相多見，異型性明顯；腫瘤組織間質(zhì)中少見淋巴細胞浸潤。

調(diào)氣消積湯組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對照組略小，形態(tài)不規(guī)則，腫瘤切開時可見部分壞死。鏡下可見腫瘤細胞仍密集排列，但細胞密度較荷瘤對照組有所減低，染色質(zhì)濃縮邊集，病理性核分裂相減少，異型細胞較少；部分瘤組織破壞，腫瘤組織間質(zhì)可見多少不等的炎細胞浸潤。

順鉑組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對照組明顯減小，形態(tài)不規(guī)則，個別標本瘤體不完整，腫瘤切開時多見壞死組織。鏡下可見腫瘤細胞密度明顯減低，多有腫脹、變性，病理性核分裂相明顯減少，異型細胞明顯減少；腫瘤組織內(nèi)見大片壞死，腫瘤組織間質(zhì)見較多炎細胞浸潤。

綜合組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對照組明顯減小，形態(tài)不規(guī)則，個別標本瘤體不完整，腫瘤切開時多見壞死組織。鏡下可見腫瘤細胞密度明顯減低，多有腫脹、變性，病理性核分裂相明顯減少，異型細胞明顯減少；腫瘤組織內(nèi)見大片壞死，壞死殘留的腫瘤細胞周圍有大量淋巴細胞和白細胞浸潤。

3.4 Tunel原位法檢測Lewis肺腫瘤細胞凋亡 在激光共聚焦顯微鏡下觀察Lewis肺腫瘤移植瘤細胞的凋亡，正常的活細胞不著色，凋亡的細胞呈綠色熒光。結(jié)果顯示荷瘤對照組異硫氰酸熒光素（FITC）標記的肺腫瘤細胞低染，少見凋亡形態(tài)的細胞。調(diào)氣消積湯組、順鉑組及綜合組的肺腫瘤細胞均高染，呈綠色熒光，表明各治療組移植瘤出現(xiàn)了大量凋亡的肺腫瘤細胞，其中綜合組綠色熒光強度最大。

4 討論

中醫(yī)藥治療惡性腫瘤著眼于“治病求本”的原則，與手術(shù)、放療、化療等局部殺滅方法最大的不同是強調(diào)整體調(diào)節(jié)，多方入手及全身治療，通過中藥復(fù)方中多種成分，多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點綜合調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。

從多年的臨床實踐中體會到，晚期肺腫瘤患者，由于氣機紊亂，升降失常導(dǎo)致的癥狀較多，因此重視升降辨證，調(diào)整氣機的升降紊亂，采用“和法”調(diào)節(jié)肝氣，使用柴胡劑化裁治療晚期肺腫瘤，取得了較好的療效[3]。針對肺腫瘤的致病特點，篩選有效藥物立法組方而成的調(diào)氣消積湯是在小柴胡湯原方基礎(chǔ)上加味而來，在治療中重視升降理論的應(yīng)用，注重人體氣機運動的調(diào)暢，是臨床治療肺腫瘤的有效方劑。方中柴胡輕清升散、宣透疏解，既可向外以解表，又能向上以升陽，還可疏泄肝膽，肝膽疏則氣行有序，升降出入?yún)f(xié)調(diào)平衡；黃芩苦寒，長于清泄肺熱，與柴胡合用可疏解少陽郁滯之邪熱，使氣機通達，樞機調(diào)和，兩者共為方中君藥；生牡蠣重鎮(zhèn)安神，軟堅散結(jié)；白花蛇舌草、莪術(shù)清熱解毒、活血化瘀，三藥共為臣藥；生姜、半夏和胃止嘔，燥濕化痰，辛開散結(jié)，能開能降為佐藥；人參、天門冬、甘草、大棗為使，益氣養(yǎng)陰潤肺，補益脾胃，調(diào)氣和中，具有增強中焦樞轉(zhuǎn)氣機，調(diào)和方中諸藥的作用。全方配伍升中有降，散中有收，調(diào)氣機，補肺氣，軟堅散結(jié)，活血化瘀，共奏調(diào)暢氣機，抗肺腫瘤之效。

通過本實驗可以看出，與荷瘤對照組比，經(jīng)調(diào)氣消積湯治療后的荷瘤小鼠，進食量增加，一般生活狀況改善，5min自主活動及站立次數(shù)增加，并抑制腫瘤的生長，兩者差異有統(tǒng)計學意義。順鉑組荷瘤小鼠的一般狀況最差，反應(yīng)非常遲鈍，基本喪失了站立的能力；而且在實驗條件均一，無人為操作失誤的情況下，有1只小鼠死亡，由此可以看出，雖然化療藥物抗腫瘤的能力較強，但是同時也損傷了正常細胞，對荷瘤小鼠的全身都有損害，有很強的毒副作用。綜合組荷瘤小鼠的一般生活狀況較順鉑組改善，且抑瘤率最高。以上實驗結(jié)果說明，調(diào)氣消積湯可以改善Lewis小鼠的一般狀況，對肺腫瘤細胞的生長有抑制作用；與化療藥物合用可以提高療效，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，減輕化療毒副反應(yīng)，從而提高荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。

細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡過程，是細胞衰老自然死亡的主要方式之一。在生物化學變化方面，凋亡的一個顯著的特征就是細胞染色質(zhì)DNA的降解。TUNEL法是1993年Wijsman等[4]提出的細胞凋亡的原位檢測法，是一種將分子生物學與形態(tài)學相結(jié)合的研究方法。該方法靈敏度高，可以特異準確地定位正在凋亡的細胞，凋亡細胞產(chǎn)生的信號強度比非凋亡細胞高數(shù)十倍，測定凋亡細胞的靈敏度要比壞死細胞高10倍。實驗結(jié)果顯示荷瘤對照組FITC標記的肺腫瘤細胞低染，少見凋亡形態(tài)的細胞。調(diào)氣消積湯組、順鉑組及綜合組的肺腫瘤細胞均高染，呈綠色熒光，表明各治療組移植瘤出現(xiàn)了大量凋亡的肺腫瘤細胞，其中綜合組綠色熒光強度最大。實驗證明了調(diào)氣消積湯抑制Lewis肺腫瘤細胞的作用，可能與促進肺腫瘤細胞凋亡有關(guān)；該方與化療藥物同用，可增強促肺腫瘤細胞凋亡的能力。

中醫(yī)藥治療腫瘤在治療的過程中更重視患者的主觀感受，有較好的改善癥狀、提高生存質(zhì)量和延長生存時間的作用，雖瘤體縮小不一定明顯，但通過穩(wěn)定瘤體、緩解癥狀使患者長期帶瘤生存。大量的實驗證明，中西醫(yī)結(jié)合對惡性腫瘤的治療有著巨大的優(yōu)勢和潛力，其治療效果優(yōu)于單純的中醫(yī)和單純的西醫(yī)治療[5-6]。

[1]劉建文.藥理實驗方法學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2003：22－23.

[2]孫敬方.動物實驗方法學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：357.

[3]邢向榮，殷東風.運用柴胡劑從肝論治提高惡性腫瘤患者生存質(zhì)量的臨床分析[C].第十屆全國中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學術(shù)大會，2006：320－325.

[4]Cheng YL,Chang WL,Lee SC,et al.Acetone extract of Angelica sinensis Inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cyclearrestand apoptosis[J].Life Sci,2004,75(13):1579-1594.

[5]周岱翰，林麗珠，周宜強，等.非小細胞肺癌三種治療方案的成本—效果分析[J].中國腫瘤臨床，2005，32（19）：1081－1084.

[6]賈英杰，李小江，陳 亮，等.中醫(yī)藥在治療癌性疼痛中的研究進展[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2011，30（1）：58-60.

Effectsof the Tiaoqixiaojidecoction on anti-tumor and apoptosis inm icewith Lew is lung cancer

LIANG Jing-jing,CHENSu-ning,WANGXiao-feng,etal
(TCM department,Shengjing Hospital Affiliated to ChineseMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

[Objective]Toexplore the therapeutic effectof Tiaoqixiaoji(TQXJ)decoction on anti-tumoreffectand apoptosisof Lewis lung cancer-bearingmice.[Methods]C57BL/6micewere inoculated with Lewis lung cancer cells routinely.Then theywere random ly divided into:modelgroup(MG),TQXJgroup(TG),DDP(Cisplatin)group(DG)and TQXJ-DDPgroup(ZG),with 10mice in each group.Different drugswere given to each group in order to observe the daily life and the tumorgrowing statusof themice.Determination of the cellapoptosis in the tumorous tissuewas performed by TUNELmethod.[Results]The generalstatusof the Lewis tumor-bearingmice could be improved by TQXJDecoction comparedwith MGgroup(P<0.01).The tumorweightofeach treatmentgroupwas lighter than theMG(P<0.01).Therewere some cellmorphological changes of the TG,DG and ZG,including the chromatin condensed inmargin and the pathological karyokinesis reduced obviously compared with the MG.In situ TUNEL assay showed that increased apoptotic cells could be seen in all treatmentgroups;the green fluorescence intensitywashigh and the ZGwashighest.[Conclusion]TQXJDecoction iseffective in improving the general life statusof tumor-bearingmice，and it can inhibit the growth of the Lewis lung cancer,and also can induce the apoptosis of the Lewis lung cancer cells.

Tiaoqixiaojidecoction;Lewis lung cancer;apoptosis

梁靚靚（1971-），女，博士，講師，主治醫(yī)師，1995年畢業(yè)于遼寧中醫(yī)藥大學醫(yī)療系，2010年獲得該校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)博士學位，主要從事惡性腫瘤的中醫(yī)藥基礎(chǔ)與臨床研究，曾于1999—2003年在阿聯(lián)酋Modern Ployclinic工作4年，目前在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科工作；近年來共發(fā)表學術(shù)論文20余篇，參與省、市級課題3項，博士畢業(yè)論文獲遼寧中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)醫(yī)學院優(yōu)秀畢業(yè)論文，現(xiàn)擔任遼寧省中西醫(yī)結(jié)合學會腫瘤專業(yè)、血液病專業(yè)委員會委員。

R734.2

A

1672-1519(2011)04-0277-04

2011-01-16）