畢明慧 陳 堅*

上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院老年病科1（200031） 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院消化內(nèi)科2

目前越來越多的研究證實具有抗氧化作用的中藥單體（如丹參素、丹參酮、銀杏黃酮、茶多酚等）對腫瘤治療和預(yù)防具有良好的效果[1～3]。丹參素是一種酚性芳香酸類化合物，具有明顯的抗炎、抗氧化作用。近年丹參素因其抗腫瘤活性而成為研究的熱點，但其具體作用機(jī)制仍未完全闡明。正常細(xì)胞的增殖、分化和凋亡處于平衡，而腫瘤細(xì)胞能無限增殖、分化受阻、凋亡受抑[4]，故誘導(dǎo)凋亡是腫瘤治療的重要途徑。本研究通過采用不同濃度的丹參素體外干預(yù)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721，旨在分析其對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用，并初步探討作用機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人肝癌細(xì)胞株SMMC7721購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

丹參素純品（純度>97%）購自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室。取丹參素10 mg溶于5 ml PBS中后過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。RNA提取試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Gibco公司。MTT試劑、Taq DNA聚合酶購自Promega（北京）生物技術(shù)有限公司。

美國Coulter公司EPICS Elite型流式細(xì)胞儀，日本JEOL公司JEM-1200EX透射電子顯微鏡，日本Olympus倒置相差顯微鏡，德國Biometra PCR儀。

二、實驗方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將SMMC7721細(xì)胞加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞，常規(guī)胰酶法消化、收集細(xì)胞，計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞濃度。

2.MTT法：按每孔1×104密度接種于96孔板，每孔200μl。12 h待細(xì)胞貼壁良好后，加入含丹參素的培養(yǎng)基，丹參素的終濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L；以不加丹參素的培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對照組。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20μl，37 ℃孵育4 h；棄上清液后加入 DMSO 150μl，振蕩 10 min。上酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度（A）值，檢測波長為490 nm。計算細(xì)胞生長抑制率，抑制率（%）=（對照組A值-實驗組A值）/對照組A值×100%。

3.細(xì)胞形態(tài)：取對數(shù)生長期SMMC7721細(xì)胞，加入終濃度為40 mg/L的丹參素，置于5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每8 h倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。24 h后結(jié)束培養(yǎng)，制備切片，透射電子顯微鏡下觀察、拍片。

4.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期SMMC7721細(xì)胞，加入含丹參素的培養(yǎng)基，使其終濃度分別為 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞待測；另取對數(shù)生長期SMMC7721細(xì)胞，加入終濃度為40 mg/L的丹參素，分別于培養(yǎng) 0、12、24、36、48 h 后檢測細(xì)胞凋亡。上述藥物干預(yù)均以不加丹參素的細(xì)胞作為對照。胰酶法消化收集貼壁細(xì)胞，2000 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 106/ml。 先后加入 10μl Annexin V-FITC 和 5μl PI，混勻后室溫避光孵育15 min；上流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長為488 nm，檢測波長為560 nm。

5.RT-PCR法檢測p53 mRNA表達(dá)：取生長良好的SMMC7721細(xì)胞，加入含丹參素的培養(yǎng)基，使其終濃度分別為 0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，24 h后收集細(xì)胞。以TRIzol一步法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR反應(yīng)。各基因引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，p53 上 游 引 物 ：5’-GTG GCC TCT GTC ATC TTC CG-3’， 下 游 ：5’-CCG TCA CCA TCA GAG CAA CG-3’，片段長度291 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，下游：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，片段長度 703 bp。PCR 反應(yīng)體系 50μl，反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；62 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；30個循環(huán)，最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，自動凝膠成像分析系統(tǒng)掃描記錄圖像，測定光密度（OD）值，目的基因mRNA表達(dá)以p53條帶OD值與β-actin條帶OD值的比值來表示。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件。樣本率的比較采用χ2檢驗；多樣本均數(shù)比較用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞增殖

MTT法示，不同濃度的丹參素對SMMC7721細(xì)胞增殖均有抑制作用。10 mg/L丹參素即可抑制細(xì)胞生長，且隨著濃度的升高以及干預(yù)時間的延長，抑制效應(yīng)明顯遞增（P<0.05），即丹參素呈時間和劑量依賴性地抑制SMMC7721細(xì)胞增殖（見圖1）。

圖1 不同濃度丹參素作用24、48和72 h后對SMMC7721細(xì)胞的抑制

二、細(xì)胞形態(tài)

40 mg/L丹參素作用8 h后，SMMC7721細(xì)胞貼壁能力下降，部分細(xì)胞皺縮、變圓，折光性升高；作用16 h后，細(xì)胞之間失去緊密聯(lián)接，小部分細(xì)胞漂??；作用24 h后，大部分細(xì)胞漂浮，并可見細(xì)胞碎片。透射電子顯微鏡下示不同階段的典型凋亡細(xì)胞以及破碎的壞死細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞可見染色質(zhì)邊集，在細(xì)胞核膜周邊形成新月體形（見圖2A）；隨之染色體發(fā)生固縮，DNA片段化，顯示電子密度增強(qiáng)的核碎片；細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，但其內(nèi)的細(xì)胞器仍保存較好；細(xì)胞膜保存完整，細(xì)胞膜表面微絨毛減少或消失；可見細(xì)胞膜芽生出泡現(xiàn)象。凋亡晚期可見核膜包裹的內(nèi)含細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片的凋亡小體（見圖2B）。

圖2 不同凋亡時期SMMC7721細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖（×2000）

三、細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)示作用24 h后，丹參素呈劑量依賴性地誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡和壞死，其中40 mg/L丹參素的促凋亡作用最為明顯（見圖3）。

圖3 不同濃度丹參素作用24 h后SMMC7721細(xì)胞凋亡率和壞死率比較

40 mg/L丹參素作用SMMC7721細(xì)胞不同時間后，呈時間依賴性地誘導(dǎo)凋亡和壞死（見圖4），其中48 h時的作用最為明顯，SMMC7721細(xì)胞幾乎全部凋亡或壞死，且以凋亡為主要效應(yīng)。

四、p53 mRNA表達(dá)

RT-PCR法示隨著丹參素干預(yù)SMMC7721細(xì)胞濃度的升高，p53 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（見圖5）。說明丹參素誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡與p53基因表達(dá)有密切關(guān)系。

圖4 40 mg/L丹參素作用不同時間后SMMC7721細(xì)胞凋亡率和壞死率比較

圖5 不同濃度丹參素作用后p53 mRNA表達(dá)的PCR電泳圖

討 論

丹參素是一種新型的酚性芳香酸類化合物，早在1991年，Wu等[5]將分離自丹參氯仿提取物的15種成分作用于人鼻咽癌細(xì)胞株KB、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人結(jié)腸癌細(xì)胞株COLO 205和人喉癌細(xì)胞株Hep-2，發(fā)現(xiàn)其對癌細(xì)胞均有不同程度的殺傷作用。楊華等[6]發(fā)現(xiàn)丹參素可通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制胃癌MGC803細(xì)胞生長，且細(xì)胞中cyclin B1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而caspase-3和caspase-6活性顯著升高。膽固醇是真核細(xì)胞生長分裂過程中必不可少的物質(zhì)，方杰[7]發(fā)現(xiàn)丹參素能通過阻斷腫瘤細(xì)胞膽固醇合成而抑制乳腺癌細(xì)胞生長。但郭自強(qiáng)等[8]的研究發(fā)現(xiàn)丹參素能通過抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用；龐鶴等[9]證實丹參素可抑制缺氧/缺糖損傷所致的線粒體膜電位和活性的降低，從而具有穩(wěn)定線粒體膜電位的作用，抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。由此可見，丹參素對不同類型的細(xì)胞凋亡具有相反作用，這可能由于腫瘤細(xì)胞的能量代謝和信號通路與正常細(xì)胞不同所致[10]。本研究中，丹參素可呈時間和劑量依賴性地抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖，并時間和劑量依賴性地誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡，與透射電子顯微鏡的結(jié)果一致。

腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化過程均涉及氧自由基的增多；自由基可作為第二信使調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子活性、早期基因表達(dá)等，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化[11]。申亮等[1]應(yīng)用量子化學(xué)法計算丹參素的O-H鍵解離焓和電離勢，并以此為理論指標(biāo)評價其清除自由基的活性。結(jié)果顯示丹參素具有較高的清除自由基的活性。劉珊林等[12]證實丹參素能清除SMMC7721細(xì)胞的內(nèi)源性活性氧，減少H2O2的產(chǎn)生，通過阻斷活性氧上調(diào)的PKB以及c-fos/cjun信號通路，從而抑制SMMC7721細(xì)胞的生長。

p53是一種抗癌基因，其高表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對正常細(xì)胞而言，p53所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是對某些DNA損傷因子（如放射線、化療藥物等）的保護(hù)反應(yīng)。p53的活化可通過誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1基因表達(dá)增加，使細(xì)胞阻滯于G1/S期[13,14]；如DNA未得到及時修復(fù)，p53繼續(xù)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)增加[15]，使抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax之間的平衡失調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13,16]。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，隨著丹參素濃度增強(qiáng)，p53基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，說明丹參素干預(yù)可上調(diào)野生型p53表達(dá)。p53表達(dá)增強(qiáng)是丹參素促進(jìn)細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制之一。但細(xì)胞凋亡過程存在一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由多種凋亡相關(guān)基因或信號通路參與并相互影響，因此有待進(jìn)一步深入研究各信號途徑之間的相互聯(lián)系和作用。

綜上所述，丹參素在一定濃度范圍內(nèi)呈時間和劑量依賴性地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞壞死和凋亡，其機(jī)制可能與p53表達(dá)上調(diào)有關(guān)。目前對丹參素的研究尚處于藥理觀察和臨床前期階段，今后應(yīng)重點對其單體進(jìn)一步純化和結(jié)構(gòu)改造，同時深入研究其抗腫瘤作用的分子機(jī)制，以便能將丹參素等中藥單體開發(fā)成為一種新型的高效低毒的抗腫瘤藥物。

1 申亮,紀(jì)洪芳,柴建國,等.對九種天然產(chǎn)物清除自由基活性的理論評價.生物物理學(xué)報,2005,21 (5):332-338.

2 Zhang LJ,Chen L,Lu Y,et al.Danshensu has anti-tumor activity in B16F10 melanoma by inhibiting angiogenesis and tumor cell invasion.Eur J Pharmacol,2010,643(2-3):195-201.

3 陳堅,鐘良,錢立平,等.丹參酮ⅡA誘導(dǎo)SGC7901胃癌細(xì)胞凋亡及機(jī)制.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,34(1):57-61,65.

4 Fabregat I.Dysregulation of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells.World J Gastroenterol,2009,15(5):513-520.

5 Wu WL,Chang WL,Chen CF.Cytotoxic activities of tanshinones against human carcinoma cell lines.Am J Chin Med,1991,19(3-4):207-216.

6 楊華,程金建.丹參素對胃癌MGC803細(xì)胞周期的影響及凋亡誘導(dǎo)作用.山東醫(yī)藥,2010,50(36):28-30.

7 方杰.丹參素對乳腺癌MCF細(xì)胞株的作用.中國老年醫(yī)學(xué)雜志,2003,23(3):168-169.

8 郭自強(qiáng),王碩仁,朱陵群,等.丹參素和川芎嗪對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2006,4(6):494-495.

9 龐鶴,朱陵群,張文生,等.丹參素對缺氧/缺糖損傷的神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位和凋亡的影響.中華中醫(yī)藥雜志,2006,21(6):329-332.

10 施冬云,劉珊林,李浩然,等.缺氧應(yīng)激對肝癌細(xì)胞代謝信號通路的調(diào)節(jié)作用.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2006,33(9):869-876.

11 Souici AC,Mirkovitch J,Hausel P,et al.Transition mutation in codon 248 of the p53 tumor suppressor gene induced by reactive oxygen species and a nitric oxidereleasing compound.Carcinogenesis,2000,21 (2):281-287.

12 劉珊林,劉冠中,程建,等.蛋白激酶對活性氧調(diào)節(jié)7721人肝癌細(xì)胞生長的影響.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,2002,34(1):67-72.

13 Kuo PL, Lin CC. Green tea constituent (-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits Hep G2 cell proliferation and induces apoptosis through p53-dependent and Fas-mediated pathways.J Biomed Sci,2003,10(2):219-227.

14 Punj V,Chakrabarty AM.Redox proteins in mammalian celldeath:an evolutionarily conserved function in mitochondria and prokaryotes.Cell Microbiol,2003,5(4):225-231.

15 Eissing T,Waldherr S,Allg?wer F,et al.Response to bistability in apoptosis:roles ofbax,bcl-2,and mitochondrial permeability transition pores.Biophys J,2007,92(9):3332-3344.

16 Kim CH,Yoo YM.Melatonin induces apoptotic cell death via p53 in LNCaP cells.Korean JPhysiol Pharmacol,2010,14(6):365-369.