馬麗娟 呂 賓* 孟立娜 范一宏 金海峰

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（310006）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）是以腹痛或腹部不適并伴有排便異常為特征的一種功能性腸病[1]。目前IBS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其可能的病理生理機(jī)制包括腸道動(dòng)力異常、內(nèi)臟高敏感、腦-腸軸相互作用、炎癥、腸道神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失常等，其中內(nèi)臟敏感性增高是其特征性的主要病理生理基礎(chǔ)[2]。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase,PDI）是一種主要存在于哺乳動(dòng)物和酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的多功能蛋白，PDIA3是該家族中巰基蛋白氧化還原酶的重要組分。本課題組的前期研究[3]發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟高敏感大鼠模型結(jié)腸組織中PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)，但其在腹瀉型IBS（IBS-D）患者結(jié)腸黏膜中的蛋白表達(dá)及其意義尚不清楚。本研究通過檢測(cè)PDIA3在IBS-D患者結(jié)腸黏膜中的蛋白表達(dá)變化，旨在初步探討其在IBS發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

一、患者來源

選取2009年2～8月至浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科就診的IBS-D患者15例，診斷符合羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中男6例，女9例；年齡23～72歲，平均48.6歲；病程1～15年，中位病程 6.2年。同時(shí)排除符合下列標(biāo)準(zhǔn)者：①腹腔疾病、感染性腸炎、內(nèi)分泌和中樞神經(jīng)失調(diào)、胃腸道腫瘤患者；②就診前一個(gè)月內(nèi)服用抗過敏藥、促胃腸動(dòng)力藥、非甾體消炎藥、神經(jīng)精神類藥物等的患者。選取同期主動(dòng)要求行結(jié)腸鏡檢查的健康體檢者15例作為對(duì)照，其中男7例，女8例；年齡25～70歲，平均48.1歲。兩組性別構(gòu)成比、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

采用隨機(jī)數(shù)表法將IBS-D組和對(duì)照組患者進(jìn)行編號(hào)，分別表示為I1～I(xiàn)15和N1～N15。所有研究對(duì)象均知情同意。

二、主要試劑和儀器

蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Bio-Rad公司）；預(yù)染蛋白質(zhì) Marker（Fermentas）；麗春紅染液、變性蛋白質(zhì)上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)研究所）；牛血清白蛋白（華美生物工程有限公司）；PDIA3一抗（Cell Signaling Technology）；β-actin 一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；二抗（明睿生物技術(shù)有限公司）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色劑（Santa Cruz公司）；人肥大細(xì)胞類胰蛋白酶ELISA檢測(cè)試劑盒（R&D Systems,Inc）。

SpecTM 3000紫外分光光度儀、PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc 2000紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）；ELX808酶標(biāo)儀（BioTek公司）。

三、方法

1.取材和處理：所有研究對(duì)象均接受結(jié)腸鏡檢查，回盲部取黏膜組織3塊，其中1塊以0.9%NaCl溶液漂洗3次，液氮保存，用于蛋白印跡法檢測(cè)PDIA3蛋白表達(dá)；其余2塊組織-80℃冰箱保存，用于ELISA法檢測(cè)類胰蛋白酶濃度。

2.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PDIA3蛋白表達(dá)：取結(jié)腸黏膜組織，加入RIPA裂解液勻漿、混勻后冰浴30 min；4℃ 12000 r/min離心5 min，收集上清液；DC法測(cè)定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入PDIA3和β-actin一抗（工作濃度為 1∶1000），4 ℃過夜；TBST 洗 10 min×3 次，加二抗（工作濃度為 1∶1000），室溫 1～2 h；TBST 洗10 min×3次。ECL發(fā)光自顯影。凝膠成像系統(tǒng)成像，應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參照β-actin條帶的積分光密度的比值表示。

3.類胰蛋白酶濃度測(cè)定：取2塊活檢標(biāo)本稱重后以0.9%NaCl溶液漂洗，置于1 ml HBSS平衡鹽液中，37℃孵育1 h，分離上清液[4]。采用ELISA法測(cè)定類胰蛋白酶濃度，具體步驟參照試劑盒說明書操作。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每組標(biāo)準(zhǔn)品和樣品重復(fù)2次，取均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PDIA3蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法示IBS-D患者結(jié)腸黏膜PDIA3蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見表 1、圖 1）。

二、類胰蛋白酶濃度

ELISA法示IBS-D患者結(jié)腸黏膜組織類胰蛋白酶濃度顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（見表 1）。

表1 IBS-D組和對(duì)照組PDIA3蛋白表達(dá)和類胰蛋白酶濃度比較（ ）

表1 IBS-D組和對(duì)照組PDIA3蛋白表達(dá)和類胰蛋白酶濃度比較（ ）

*與對(duì)照組比較，P<0.01

組 別 例數(shù) PDIA3蛋白表達(dá) 類胰蛋白酶（μg/g組織）IBS-D 組 15 1.20±0.33* 0.059±0.026*對(duì)照組 15 0.83±0.21 0.023±0.017

三、PDIA3蛋白表達(dá)與類胰蛋白酶濃度的關(guān)系

對(duì)照組PDIA3蛋白表達(dá)與類胰蛋白酶濃度無關(guān)（r=0.208，P=0.803），而 IBS-D 組患者 PDIA3 蛋白表達(dá)與類胰蛋白酶濃度呈正相關(guān)（r=0.750，P=0.003）。

圖1 IBS-D患者和對(duì)照組結(jié)腸黏膜PDIA3蛋白表達(dá)的電泳圖

討 論

PDI是一種多功能蛋白，能催化形成二硫鍵，具有分子伴侶活性[5]。PDI家族是一類在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中起作用的巰基-二硫鍵氧化還原酶，屬折疊酶。其主要職能是催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生肽鏈的氧化折疊，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解途徑、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣穩(wěn)態(tài)、抗原呈遞、病毒入侵等方面亦起重要作用。PDI為應(yīng)激相關(guān)蛋白[6]，易被應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生。有研究[7]顯示缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中PDI含量及其mRNA水平均有所升高，從而通過減弱內(nèi)皮細(xì)胞活力促使內(nèi)皮細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。PDIA3為PDI家族成員之一，又稱ERp57，屬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通道蛋白。PDIA3與機(jī)體免疫密切相關(guān)，Antoniou等[8]發(fā)現(xiàn)在MHC分子抗原呈遞的過程中，PDIA3分子直接進(jìn)入MHCⅠ類分子的肽結(jié)合槽中并與其結(jié)合，然后與免疫原性多肽結(jié)合并呈遞至CD8+T細(xì)胞，使T細(xì)胞活化，特異性地直接殺傷被感染的細(xì)胞。

IBS可以認(rèn)為是一種應(yīng)激障礙，應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦和其他相關(guān)腦區(qū)釋放促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子（corticotropin releasing factor,CRF），刺激結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能，產(chǎn)生超敏[9]。心理應(yīng)激可直接影響腸道動(dòng)力以及內(nèi)臟感覺，使結(jié)腸運(yùn)動(dòng)、分泌功能失調(diào)，從而引起或加重IBS癥狀。80%的IBS患者有影響其癥狀發(fā)作或加重的精神因素，尤其以焦慮和抑郁的影響最為明顯[10]。IBS患者存在免疫異常，有研究證實(shí)IBS患者結(jié)腸黏膜中存在T細(xì)胞浸潤(rùn)和肥大細(xì)胞活化，可產(chǎn)生細(xì)胞因子、組胺、蛋白酶[11]。Cremon等[12]亦發(fā)現(xiàn)IBS患者體內(nèi)CD8+T細(xì)胞和肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)增高。Ding等[3]的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激引起的內(nèi)臟高敏感大鼠模型結(jié)腸組織中PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)，提示PDIA3過表達(dá)與結(jié)腸黏膜異常免疫應(yīng)答有關(guān)，PDIA3可能為導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)中的某個(gè)重要蛋白分子。本研究中，IBS-D患者結(jié)腸黏膜PDIA3蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，提示其可能參與了IBS-D患者結(jié)腸黏膜的異常免疫應(yīng)答。

腸道肥大細(xì)胞位于黏膜血管、淋巴和神經(jīng)附近，既具有免疫活性，又能分泌多種介質(zhì)，是腸道主要的抗原感受器，參與腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)。肥大細(xì)胞在IBS的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，多項(xiàng)研究[13,14]證實(shí)IBS患者回盲部肥大細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照者，尤其是在腹瀉型患者中[15]。當(dāng)某種抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，可引起感覺神經(jīng)末梢興奮以及信號(hào)傳遞，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體?？乖c抗體結(jié)合可引起肥大細(xì)胞活化、脫顆粒，并釋放多種生物活性介質(zhì)如類胰蛋白酶、組胺、5-羥色胺、前列腺素等，其中類胰蛋白酶幾乎是肥大細(xì)胞分泌顆粒所特有的中性蛋白酶，是肥大細(xì)胞活化和脫顆粒的特異性標(biāo)記[16]。類胰蛋白酶是蛋白酶激活受體-2（PAR-2）的強(qiáng)激活劑，而PAR-2的活化與內(nèi)臟高敏感密切相關(guān)[17,18]。臨床研究[4]發(fā)現(xiàn)IBS患者結(jié)腸胰蛋白酶、類胰蛋白酶表達(dá)以及蛋白水解活性增加，其上清給予小鼠灌腸后可通過激活PAR-2引起內(nèi)臟高敏感。國(guó)內(nèi)有研究[19]提示IBS-D患者升結(jié)腸黏膜肥大細(xì)胞數(shù)量和類胰蛋白酶含量均明顯增加，且其結(jié)腸黏膜孵育上清液可導(dǎo)致小鼠內(nèi)臟感覺過敏，提示類胰蛋白酶可能參與IBS-D患者內(nèi)臟敏感性的改變。本研究結(jié)果顯示IBS-D患者回盲部黏膜孵育上清液類胰蛋白酶濃度顯著高于對(duì)照組，并與PDIA3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示IBS-D患者結(jié)腸黏膜PDIA3過表達(dá)可能促進(jìn)了肥大細(xì)胞的活化并釋放類胰蛋白酶，導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高。

綜上所述，IBS-D患者結(jié)腸黏膜PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，同時(shí)亦可能促進(jìn)了肥大細(xì)胞的活化并釋放類胰蛋白酶，從而導(dǎo)致內(nèi)臟敏感性增高。但其具體途徑尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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