李海鵬 楊東升 王立豐 關(guān)尚一 丁樹哲 盧健

1 上海體育學(xué)院運動科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

2 華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院

3 浙江工業(yè)大學(xué)體質(zhì)健康研究中心

Sarcopenia（肌肉衰減征，又稱肌力流失）是一種以骨骼肌質(zhì)量減少、肌肉力量及耐力顯著下降為主要特征的衰老性機能減退，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量[1，2]。有研究表明，Sarcopenia的發(fā)生涉及細(xì)胞凋亡、蛋白合成減少、激素分泌不足、運動神經(jīng)元失能等多種因素，其中細(xì)胞凋亡機制逐漸成為歸因研究的焦點，而細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心——線粒體則通過Caspase依賴與非依賴性兩條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3，4]。

Kim等曾提出耐力運動能延緩Sarcopenia發(fā)生[5]。運動作為特殊應(yīng)激手段，對Sarcopenia的發(fā)生所產(chǎn)生影響的機制有待闡明。目前，運動對骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響已有不少研究，而運動對衰老骨骼肌細(xì)胞凋亡以及凋亡信號途徑中相關(guān)凋亡基因的影響卻罕見實證報道[6]。大多數(shù)研究者僅以綜述形式進(jìn)行了報道，而即使有實證研究，也多局限于檢測衰老骨骼肌凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因（Bcl-2和Bax）的變化，忽略了凋亡途徑中各凋亡基因可能存在的各向異性的真實事件，不能真正闡釋不同途徑中凋亡基因在運動干預(yù)后的變化。本實驗以快速老化小鼠（SAMP8）為研究對象，初步探究跑臺運動對小鼠骨骼肌Caspase依賴與非依賴性細(xì)胞凋亡信號途徑中各凋亡基因mRNA水平的影響，為運動預(yù)防Sarcopenia的理論提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性快速老化（SAMP8系）小鼠30只，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心（實驗動物飼養(yǎng)許可證編號：W-J津?qū)崉淤|(zhì)M準(zhǔn)字第006號）。購入后于華東師范大學(xué)實驗中心動物房IVC獨立送風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)中在SPF（Specific pathogenfree）條件下分籠飼養(yǎng)，以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料喂養(yǎng)，飼料購自上海斯萊克實驗動物公司[許可證號：SCXK（滬）2007?0005]。自由飲食、飲水。自然光照并遵循明暗周期，溫度范圍20 ± 2℃，相對濕度55±5%。實驗動物分組等情況見表1。

1.2 運動方案

表1 實驗動物分組及飼養(yǎng)和訓(xùn)練情況

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后OE組（30周齡時）開始，采用動物跑臺進(jìn)行耐力訓(xùn)練。訓(xùn)練時間選擇在暗周期（18:00～20:00），每天1次，每周5天。參照Bedford與Siu的方案[7，8]，隨動物運動具體情況適時調(diào)整。第1周速度為15 m/min，時間15 min；第2周為20 m/min×25 min；第3周為25 m/min×25 min；第4周為25 m/min×30 min；第5～8周均為30 m/min×30 min。

1.3 取材及計算SI

末次跑臺運動后24～48 h，小鼠斷頭處死，迅速取完整后肢腓腸肌，稱量肌肉重量，錫箔紙包裹并標(biāo)記后迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)錅y。選用Edstrom提出的靶骨骼肌的質(zhì)量（mg）/受試體重（g）求得 Sarcopenia Index（SI）值，并以此作為評價指標(biāo)[9]，并參照Baumgartner等的方法[10]（老年組SI值與青年組相比顯著降低，且差異大于2倍SD）進(jìn)行判定。

1.4 RNA提取及鑒定

取腓腸肌樣品100 mg左右，參照Trizol試劑盒（購自Invitrogen 公司）說明書抽提RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法（OD260/OD280）對RNA的完整性和純度進(jìn)行檢測，確認(rèn)28s、18s、5s三條帶以及OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間。

1.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄

取 RNA 2 μl以 Oligo（dT）15（50 pmol/μl）為隨機引物合成cDNA。M-MLV試劑盒購自Promega公司。

1.6 實時熒光定量PCR

查找目的基因全序列，采用Primer Express 3.0設(shè)計軟件設(shè)計引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，相關(guān)信息見表2。

Realtime PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中SYBR Premix（TOYOBO公司）10 μl，前向引物和反向引物（10 μM）各 1 μl，模板 4 μl，其余用無 RNase水補足。反應(yīng)條件為Stage 1：（1×）95℃，3 min；Stage 2：（45×）Step 1：95 ℃，20 s，Step 2：Tm，20 s，Step 3：72 ℃，20 s（收集熒光）；Stage 3：（1×）95℃，1 min；Tm，20 s；緩慢升溫（收集熒光）至95℃，10 s。經(jīng)儀器自動分析，各基因融解曲線（Melt Curve）均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。以β-actin為內(nèi)參基因，各目的基因相對量（Relative Expression，RE）按 2－ΔΔCt計算求得。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS for windows15.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以表示，利用獨立樣本t檢驗分析組間差異，顯著性水平為P < 0.05。

2 結(jié)果

2.1 SI值

OC組SI值（3.84±0.39 mg/g）較YC組SI值（4.54±0.24 mg/g）顯著下降（P < 0.05），且下降幅度大于2倍SD；OE組SI值（3.90 ± 0.62 mg/g）較OC組無顯著性差異（P > 0.05）。

2.2 骨骼肌Caspase依賴性凋亡通路中凋亡基因表達(dá)

表3顯示，與YC組相比，OC組apaf-1和Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），Cyt C和Caspase-9 mRNA表達(dá)未見明顯變化（P > 0.05）。與OC組相比，OE組CytC mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P< 0.05），Caspase-3 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），apaf-1和Caspase-9 mRNA表達(dá)未見明顯變化（P >0.05）。

表3 各組Caspase依賴性凋亡基因mRNA表達(dá)

2.3 骨骼肌Caspase非依賴性凋亡通路中凋亡基因表達(dá)

表4顯 示， 與YC組 相 比，OC組PARP mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），AIF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），Endo G mRNA表達(dá)無明顯變化（P > 0.05）。與OC組相比，OE組PARP mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），AIF mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），Endo G mRNA表達(dá)無明顯變化（P > 0.05）。

表4 各組Caspase非依賴性凋亡基因mRNA的表達(dá)

3 討論

SAMP8小鼠是一類正常發(fā)育和成熟后顯示衰老加速效應(yīng)的近交系小鼠，一般壽命約為358天（約51周齡），其在生長期（16～24周齡）與普通純種小鼠無異，但在度過生長期后迅速出現(xiàn)老化特征。故本實驗OC組及OE組SAMP8小鼠（38周齡）均已步入老年階段。OC組小鼠腓腸肌SI值較YC組小鼠顯著降低，且降幅達(dá)2倍SD以上，提示SAMP8小鼠已表現(xiàn)出Sarcopenia癥狀，這與Derave的研究結(jié)果一致[11]；然而，與OC組相比，OE組SI值未見明顯變化，提示跑臺運動未能有效增加Sarcopenia小鼠SI值。

本研究結(jié)果顯示，與YC組相比，OC組小鼠腓腸肌apaf-1、Caspase-3和PARP mRNA均顯著上調(diào)，AIF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而Cyt C、Caspase-9和Endo G mRNA表達(dá)未見顯著變化。這提示雖然Caspase-3、AIF和Endo G均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但較之Caspase非依賴性凋亡途徑，在Sarcopenia發(fā)生發(fā)展過程中，Caspase-3誘導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡途徑可能隨衰老進(jìn)程逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，而AIF（apoptosis inducing factor，凋亡誘導(dǎo)因子）和Endo G （Endonuclease G，核酸內(nèi)切酶G ）誘導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑則可能表現(xiàn)為凋亡潛能隨衰老進(jìn)程呈現(xiàn)各向異性。值得注意的是，Baker等研究發(fā)現(xiàn)，隨衰老進(jìn)程，F(xiàn)344×BN （Fischer344 × Brown Norway）大鼠跖肌Caspase-3和AIF mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，且Caspase-3和AIF表達(dá)均與Sarcopenia的發(fā)生進(jìn)程高度相關(guān)[12]。此外，Marzetti等觀察到老年F344×BN大鼠腓腸肌AIF和Endo G表達(dá)顯著上調(diào)，而Cyt C未見隨衰老進(jìn)程出現(xiàn)顯著變化，由此該研究者認(rèn)為，線粒體介導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡信號途徑較Caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號途徑在Sarcopenia的發(fā)生進(jìn)程中發(fā)揮更重要的作用[13]。但以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果大相徑庭，其原因可能是Sarcopenia在骨骼肌衰老進(jìn)程中對凋亡途徑的選擇可能有一定的物種差異性。鑒于目前國內(nèi)尚無F344×BN大鼠種源的提供，因而只能選取較理想的SAMP8小鼠進(jìn)行研究，這也提示Sarcopenia發(fā)生機制的凋亡歸因不能一概而論。Pistilli研究認(rèn)為，雖然促凋亡環(huán)境可能導(dǎo)致衰老性骨骼肌萎縮，但具體凋亡途徑可能因衰老程度以及實驗動物等因素不同而存在差異[14]。這為本文的實驗結(jié)果提供了有效的解釋依據(jù)。

本研究中，跑臺運動顯著上調(diào)了腓腸肌Cyt C和AIF mRNA表達(dá)，顯著下調(diào)了Caspase-3和PARP mRNA表達(dá)，而apaf-1、Caspase-9和Endo G mRNA未見明顯變化，提示正常情況下，Cyt C和AIF均被限制在線粒體間隙內(nèi)，當(dāng)受到凋亡信號刺激時，Cyt C和AIF分子可從線粒體釋放到細(xì)胞漿中，其中Cyt C通過與apaf-1、Procaspase-9以及ATP等形成凋亡小體誘導(dǎo)Caspase依賴性凋亡，而AIF可再通過核定位信號轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中結(jié)合DNA并激活染色體凝聚，引起DNA呈大片段斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而在運動干預(yù)下，由于磷酸原供能系統(tǒng)主要參與運動供能，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP穩(wěn)態(tài)失衡，雖然Cyt C有所上調(diào)，但不能形成功能完整的凋亡小體復(fù)合物，從而無法誘導(dǎo)激活凋亡效應(yīng)子——Caspase-3表達(dá)。本研究中Caspase-3下調(diào)則可能由獨立于線粒體之外的其他途徑完成，并在一定程度上對衰老骨骼肌萎縮起保護(hù)作用[15]。Song等的研究結(jié)果顯示，12周跑臺運動顯著下調(diào)老年大鼠腓腸肌Caspase-3表達(dá)，并弱化促凋亡信號，進(jìn)而緩解衰老骨骼肌萎縮[16]。而本研究中，雖然運動對Caspase依賴性凋亡途徑有所抑制，進(jìn)而保護(hù)衰老骨骼肌進(jìn)一步萎縮，但AIF誘導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑卻在運動過程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，進(jìn)一步誘導(dǎo)衰老骨骼肌通過該途徑進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序，而Caspase非依賴性的另一凋亡誘導(dǎo)因子——Endo G依舊表現(xiàn)為凋亡沉默。由此可見，細(xì)胞凋亡可由不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，即信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?jīng)Q定細(xì)胞命運[17]。一方面，不同信號傳導(dǎo)系統(tǒng)在不同細(xì)胞中對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用不同，或啟動或阻礙細(xì)胞凋亡；另一方面，同一信號傳導(dǎo)系統(tǒng)在不同組織/細(xì)胞中對細(xì)胞凋亡的影響存在強弱差異，甚至相反的作用。

4 總結(jié)

與Caspase非依賴性凋亡途徑相比，Caspase依賴性凋亡途徑在Sarcopenia的發(fā)生中發(fā)揮更重要的作用；跑臺運動在一定程度上能弱化衰老骨骼肌Caspase依賴性凋亡通路的促凋亡基因mRNA表達(dá)，但對AIF誘導(dǎo)的Caspase非依賴性凋亡基因mRNA的表達(dá)卻呈現(xiàn)上調(diào)作用。

[1]MarzettiE，Leeuwenburgh C. Skeletal muscle apoptosis，sarcopenia and frailty at old age. Exp Gerontol，2006，41：1234-1238.

[2]劉宇，彭千華，田石榴. 老年人肌力流失與肌肉疲勞的肌動圖研究. 體育科學(xué)，2007，27（5）：57-64.

[3]李海鵬，盧健，陳彩珍. Sarcopenia機制研究進(jìn)展. 體育科學(xué)，2007，27（11）：66-69.

[4]Siu PM，Alway SE. Response and adaptation of skeletal muscle to denervation stress: the role of apoptosis in muscle loss. Front Bio Sci，2009，14 ：432-452.

[5]Kim JH，Hwak HB，Leeuwenburgh C，et al. Lifelong exercise and mild（ 8%） caloric restriction attenuate ageinduced alterations in plantaris muscle morphology，oxidative stress and IGF-1 in the Fischer-344 rat. Exp Gerontol，2008，43 ：317-329.

[6]Lenk K，Schuler G，Adams V. Skeletal muscle wasting in cachexia and sarcopenia: molecular pathophysiology and impact of exercise training. J Cachex Sarcopenia Muscle，2010，1（1）：9-21.

[7]Bedford TG，Tipton CM，Wilson NC，et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures. J Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.

[8]Siu PM，Bryner RW，Martyn JK，et al. Apoptotic adaptations from exercise training in skeletal and cardiac muscles. FASEB J，2004，18（10）：1150-1152.

[9]Edstr?m E. Sarcopenia. Thesis of Department of Neuroscience Karolinska Institute，Stockholm，Sweden，2005. 12-24.

[10]Baumgartner RN，Koehler KM，Gallagher D，et al.Epidemiology of Sarcopenia among the elderly in New Mexico. Am J Epidemiol，1998，147（8）：755-763.

[11]Derave W，Eijnde BO，Ramaekers M，et al. Soleus muscles of SAMP8 mice provide an accelerated model of skeletal muscle senescence. Exp Gerontol，2005，40 ：562-572.

[12]Baker DJ，Hepple RT. Elevated Caspases and AIF gene expression correlate with progression of Sarcopenia during aging in male F344BN rats. Exp Gerontol，2006，41：1149-1156.

[13]MarzettiE，Wohlgemuth SE，Lees HA，et al. Agerelated activation of mitochondrial caspase-independent apoptotic signaling in rat gastrocnemius muscle. Mech Ageing Dev，2008129（9）：542-549.

[14]Pistilli EE，Siu PM，Alway SE. molecular regulation of apoptosis in fast plantaris muscles of aged rats. J Gerontol A Bio Sci Med Sci，2006，61（3）：245-255.

[15]MarzettiE，Hwang JCY，Lees HA，et al. Mitochondrial death effectors: Relevance to Sarcopenia and disuse muscle atrophy. Biochimica Biophysica Acta，2010，1800：235-244.

[16]Song W，Kwak HB，Lawler JM. Exercise training attenuates age-induced changes in apoptotic signaling in rat skeletal muscle. Antioxid Redox Signal，2006，8（3）：517-528.

[17]McConkey DJ，Orrenius S. Signal transduction pathways in apoptosis. Stem Cells，1996，14：619-631.