郭成永，焦保華，梁朝輝，盧圣奎

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

不同組別腦膠質(zhì)瘤CD133/PCNA和Nestin/PCNA雙染共表達(dá)及其臨床意義

郭成永，焦保華*，梁朝輝，盧圣奎

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

目的探討腦膠質(zhì)瘤組織中CD133陽性細(xì)胞及NeStin陽性細(xì)胞增殖指數(shù)的共表達(dá)情況及其臨床意義。方法免疫組織化學(xué)雙染色方法檢測(cè)CD133/增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及NeStin/PCNA在不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤中共表達(dá)情況，并對(duì)它們之間的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果CD133/PCNA和NeStin/ PCNA在腦膠質(zhì)瘤中，高級(jí)別組（III，IV級(jí)）表達(dá)高于低級(jí)別組（I，II級(jí)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CD133/PCNA和NeStin/PCNA在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況隨著腫瘤惡性程度的增高而增強(qiáng)，病理級(jí)別越高，表達(dá)越強(qiáng)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；免疫組織化學(xué)；臨床方案

膠質(zhì)瘤占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40.49%，其生長特點(diǎn)為浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，可累及多個(gè)腦葉，針對(duì)腦膠質(zhì)瘤雖然給予了積極的手術(shù)及放化療治療，仍很難避免其復(fù)發(fā)，危及患者生命。因此尋找腦膠質(zhì)瘤特異性治療靶點(diǎn)及治療策略的改變勢(shì)在必行。Singh等［1］研究發(fā)現(xiàn)具有干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的腫瘤細(xì)胞在腦腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是形成不同分化程度腫瘤細(xì)胞和促使腫瘤不斷生長的根源，從而稱之為腦腫瘤干細(xì)胞（brain tumor Stem cell）。膠質(zhì)瘤中腫瘤干細(xì)胞與放化療抗拒性密切相關(guān)，是惡性膠質(zhì)瘤治療失敗的主要原因。CD133和NeStin是人們最常用的膠質(zhì)瘤干/祖細(xì)胞標(biāo)記物［2］，而增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于增殖程度評(píng)價(jià)［3］。本研究通過比較CD133與PCNA和NeStin與PCNA在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的共表達(dá)來研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖指數(shù)，探索膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對(duì)腫瘤組織增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 病例資料：本研究所用95例標(biāo)本均取自河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)神經(jīng)外科200S—2009年手術(shù)切除人腦膠質(zhì)瘤組織，所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備：兔抗人CD133多克隆抗體（濃縮型，博奧森）；鼠抗人NeStin單克隆抗體（濃縮型，北京中杉）；鼠抗人PCNA單克隆抗體（濃縮型，北京中杉）；SP免疫組織化學(xué)試劑盒購于河北博海生物公司；DAB顯色劑，堿性磷酸酶底物5-溴-4-氨-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍(lán)顯色濃縮液購于北京中杉生物技術(shù)有限公司公司。光學(xué)顯微鏡（Leica）及光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)（olympuS）；石蠟自動(dòng)包埋脫水機(jī)，連續(xù)切片機(jī)（Leica）切片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片，按常規(guī)SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，CD133一抗（1∶100），NeStin（1∶100），用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，復(fù)染，高倍顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 雙重免疫組織化學(xué)染色：95例均在另一部分研究中進(jìn)行CD133、NeStin表達(dá)的檢測(cè)，其中證實(shí)存在CD133表達(dá)的62例膠質(zhì)瘤標(biāo)本納入本研究進(jìn)行CD133/PCNA共表達(dá)研究（參照WHO 2007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［4］）其中WHOⅠ級(jí)、WHOⅡ級(jí)為低級(jí)別，計(jì)21例；WHOⅢ級(jí)、WHOⅣ級(jí)為高級(jí)別，計(jì)41例。在另一部分實(shí)驗(yàn)中證實(shí)存在NeStin表達(dá)的70例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本納入本研究進(jìn)行NeStin/PCNA共表達(dá)研究（參照2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)）其中WHOⅠ級(jí)、WHOⅡ級(jí)為低級(jí)別，計(jì)23例，WHOⅢ級(jí)、WHOⅣ級(jí)為高級(jí)別，計(jì)47例。由于所購一抗部分為同一來源試劑，所以均采用間接二步法進(jìn)行免疫雙染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，切片置于枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸（120℃，15～20 min）進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫，用PBS液沖洗，血清封閉后37℃孵育0.5h，加一抗后，4℃過夜，第2天PBS漂洗，加二抗37℃孵育0.5h，PBS漂洗，加三抗37℃孵育0.5h，DAB顯色后，PBS漂洗，加二標(biāo)一抗，4℃過夜，第3天PBS漂洗，最后加入二標(biāo)二抗三抗過程同前，堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素（1∶200）顯色，復(fù)染細(xì)胞核，蒸餾水漂洗30min，9S%甘油封片，其中用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，9S%甘油封片觀察，染色結(jié)果封片。

1.4 結(jié)果判斷：PCNA為核抗原，定位于增殖期細(xì)胞核，以胞核出現(xiàn)棕褐色染色為陽性，CD133與PCNA共表達(dá)為同一細(xì)胞內(nèi)胞漿或胞膜出現(xiàn)褐紅色，胞核出現(xiàn)棕褐色為陽性。NeStin與PCNA共表達(dá)為同一細(xì)胞內(nèi)胞漿或胞膜出現(xiàn)褐紅色，胞核出現(xiàn)棕褐色為陽性。以上結(jié)果均在低倍鏡和高倍鏡下觀察，并在高倍鏡（×400）下隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)標(biāo)記細(xì)胞，計(jì)算雙染陽性細(xì)胞數(shù)占標(biāo)記細(xì)胞總數(shù)的百分比，PCNA陽性率剔除了血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，每個(gè)腫瘤標(biāo)本計(jì)數(shù)3張切片，計(jì)數(shù)結(jié)果取3張切片計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤CD133/PCNA（C/P）共染陽性細(xì)胞增殖指數(shù)及其與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系：低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中C/P共表達(dá)呈陰性或低表達(dá)（圖1A、B）高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中呈強(qiáng)的C/P共表達(dá)（圖1C，D），CD133陽性細(xì)胞增殖率，低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中CD133陽性細(xì)胞率低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤組織CD133陽性細(xì)胞增殖率及其與病理級(jí)別關(guān)系Table 1 The relationship between tumor grading and CD133-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

2.2 腦膠質(zhì)瘤NeStin/PCNA（N/P）共染陽性細(xì)胞增殖指數(shù)及其與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的關(guān)系：低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中NeStin與PCNA共表達(dá)呈陰性或低表達(dá)（圖2A、B），高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織瘤細(xì)胞中呈強(qiáng)的NeStin與PCNA共表達(dá)（圖2C、D），NeStin陽性細(xì)胞增殖率在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中NeStin陽性細(xì)胞率低于高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 腦膠質(zhì)瘤組織Nestin陽性細(xì)胞增殖率及其與病理級(jí)別關(guān)系Table 2 The relationship between tumor grading and Nestin-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

3 討 論

長期以來，膠質(zhì)瘤的病因、起源和治療一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題，存在多種假說和爭議，至今仍無明確的結(jié)論，而腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞假說的發(fā)現(xiàn)，為膠質(zhì)瘤的起源提供了新的思路［5］。該學(xué)說認(rèn)為腦膠質(zhì)瘤之所以能夠發(fā)生惡性生長，與腫瘤內(nèi)存在少量的增殖活性旺盛的腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)，這些少量的具有干細(xì)胞屬性的腫瘤細(xì)胞能夠通過對(duì)稱性分裂形成子代干細(xì)胞，不對(duì)稱性分裂形成子代干細(xì)胞和腫瘤前體細(xì)胞，隨著干細(xì)胞池的逐漸擴(kuò)大而形成腦腫瘤，并表達(dá)腦腫瘤干細(xì)胞特征性標(biāo)志物CD133和NeStin，因此在理論上神經(jīng)上皮腫瘤中NeStin或CD133的陽性細(xì)胞率能夠代表著腦腫瘤干細(xì)胞在異質(zhì)性腫瘤組織內(nèi)部的含量。Shibahara等［6］根據(jù)腫瘤中NeStin免疫組織化學(xué)表達(dá)的數(shù)量和強(qiáng)度來判斷膠質(zhì)瘤的惡性程度，他們發(fā)現(xiàn)NeStin表達(dá)呈近血管簇狀或巢狀分布，有利于腫瘤細(xì)胞的自我更新、增殖及沿細(xì)胞間隙侵襲性生長的特性。而作為反映腫瘤干細(xì)胞特性的另外一個(gè)指標(biāo)CD133，被認(rèn)為是迄今為止發(fā)現(xiàn)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞最重要的標(biāo)記物之一，主要在干細(xì)胞及前體細(xì)胞上［7］，通過免疫組織化學(xué)的方法證實(shí)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中CD133陽性細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，惡性程度越高的腫瘤中CD133陽性細(xì)胞比例就越高，二者呈正相關(guān)［8］。PCNA可作為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，為DNA聚合酶輔助蛋白，調(diào)節(jié)DNA的合成，影響細(xì)胞增殖；同時(shí)它也是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)的程度和含量能夠反映細(xì)胞增殖活性，因而PCNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的細(xì)胞增殖和惡性程度的判斷。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［3］，通過免疫組織化學(xué)染色方法來檢測(cè)PCNA的表達(dá)，可反映細(xì)胞增殖活性，其陽性率和陽性強(qiáng)度與腫瘤分級(jí)、分期以及預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，以上各指標(biāo)均能在一定程度上和（或）不同層次上反映膠質(zhì)瘤惡性增殖的生物學(xué)特性，國內(nèi)外研究成功利用雙染技術(shù)來檢測(cè)CD133/ KI67共表達(dá)情況，能夠更好的反映患者預(yù)后［9］。那么作為腫瘤增殖指標(biāo)的PCNA與CD133、NeStin共表達(dá)是否同樣能夠表現(xiàn)出其優(yōu)點(diǎn)。本文通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，發(fā)現(xiàn)在低級(jí)別組和高級(jí)別組膠質(zhì)瘤中CD133/PCNA共染陽性率細(xì)胞分別為42.S6%及73.17%，經(jīng)檢驗(yàn)2個(gè)級(jí)別組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同樣NeStin/PCNA共染陽性細(xì)胞率在低級(jí)別和高級(jí)別組為47.62%和 S0.S5%，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增加，惡性程度增高，增殖率明顯升高，和已有文獻(xiàn)相一致［11］，二者呈正相關(guān)。說明在高級(jí)別的膠質(zhì)瘤中細(xì)胞分化增殖和自我更新活躍，表明膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)有其內(nèi)在必然性，我們?cè)诟呒?jí)別病理標(biāo)本中圖像中可見有未有陽性細(xì)胞表達(dá)的陰性標(biāo)本，因腫瘤干細(xì)胞有聚居現(xiàn)象巢性分部，我們想是未切到干細(xì)胞分布區(qū)，NeStin/PCNA共染細(xì)胞陽性率在低級(jí)別和高級(jí)別組均高于CD133/PCNA共染細(xì)胞陽性細(xì)胞率，我們認(rèn)為NeStin也是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)多功能干細(xì)胞標(biāo)記，因而CD133陽性細(xì)胞更具相對(duì)特異性。而這2種細(xì)胞是主要增殖細(xì)胞，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中占主要地位。CD133/PCNA或NeStin/PCNA細(xì)胞在低級(jí)別組中低表達(dá)，而在高級(jí)別組中高表達(dá)，說明在低級(jí)別組中腦腫瘤干細(xì)胞增殖力較弱或沒有增殖處于靜息狀態(tài)，而在高級(jí)別組中增殖比較活躍。在CD133和NeStin均表達(dá)的狀態(tài)下進(jìn)行CD133與PCNA和NeStin與PCNA的共表達(dá)檢驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中仍有非表達(dá)的情況出現(xiàn)，共表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明即使檢測(cè)出CD133和NeStin的表達(dá)，也不能完全反映腫瘤的術(shù)后增殖和復(fù)發(fā)情況，不能為治療提供準(zhǔn)確的反饋信息，所以可以說CD133與PCNA和NeStin與PCNA的共表達(dá)檢驗(yàn)研究為臨床提供了膠質(zhì)瘤更準(zhǔn)確信息，其臨床意義比單一檢驗(yàn)CD133和NeStin的表達(dá)為膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷更具有臨床實(shí)際意義。

值得注意的是，通過CD133/PCNA和NeStin/ PCNA共表達(dá)雙染技術(shù)，我們?cè)谀X膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了“壁龕”現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［11］，壁龕具有促進(jìn)腫瘤微血管形成，微血管的形成又促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞惡性增殖和自我更新的特性，另外壁龕可以使處于細(xì)胞周期的停滯于G0期，處于未分化的沉寂狀態(tài)，這些因素促使腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生放化療抵抗性。

總之，通過檢測(cè)CD133/PCNA、NeStin/PCNA共表達(dá)雙染技術(shù)，有利于更準(zhǔn)確地判斷膠質(zhì)瘤生物行為和評(píng)估患者預(yù)后，CD133及NeStin作為腦腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物在現(xiàn)階段具有重要意義，利用CD133/ PCNA及NeStin/PCNA的表達(dá)與腫瘤惡性程度病理級(jí)別之間的關(guān)系，研究膠質(zhì)瘤的自我更新、多向分化及其致瘤能力背后的分子機(jī)制及治療抵抗性及復(fù)發(fā)的內(nèi)在調(diào)控過程以及如何打破這種調(diào)控，為臨床診治提供依據(jù)，為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究拓展廣度和深度。最終，開發(fā)出特異的有效的生物學(xué)方法來針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行高特異性的靶向治療，那對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療將產(chǎn)生極大的推動(dòng)。（本文圖見封三）

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THE SIGNIFICANCE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL DOUBLE STAINING OF CD133/PCNA AND Nestin/PCNA COEXPRESSION IN THE BASIC AND CLINICAL GLIOMA RESEARCH

GUO Cheng-yong，JIAO Bao-hua*，LIANG Zhao-hui，LU Sheng-kui
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiangzhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the colocalization of CD133，neStin and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in human brain glioma.MethodsImmunohiStochemical double Staining method waS uSed for determining CD133 and PCNA，NeStin and PCNA co-expreSSion in human brain gliomaS reSpectively.ResultsThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/PCNA in advanced group were higher than low-grade one.The difference waS StatiStically Significant（P＜0.05）.CD133 waS poSitively correlated with PCNA.ConclusionThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/NeStin/PCNA increaSe with the malignancy degree of glioma.The higher the pathological grade，the Stronger the expreSSion.

glioma；immunohiStochemiStry；clinical protocdS

I331

A

1007-3205（2011）07-0774-04

2011-01-06；

2011-05-20

郭成永（1974-），男，河北定興人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事神經(jīng)外科學(xué)膠質(zhì)瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：jiaobh2000@163.com

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.011