劉紅 李萇清 鄭倩△

(1.川北醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室;2.川北醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,四川 南充 637100)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患病率近年呈快速增長態(tài)勢,腎臟功能損害是糖尿病常見并發(fā)癥之一。果糖二磷酸鈉(Fructose sodium diphosphate,FDP)能調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中多種酶系的活性,改善細(xì)胞缺氧、缺血的狀態(tài),延緩細(xì)胞凋亡,臨床主要用于心肌缺血、心絞痛、腦梗塞的輔助治療[1]。然而,FDP對糖尿病患者腎臟功能是否具有保護作用,特別是對腎小管中葡萄糖唯一重吸收節(jié)段-近端腎小管(Proximal tubule,PT)管周膜上的關(guān)鍵功能蛋白-鈉泵活性的影響與可能機制,目前尚未發(fā)現(xiàn)研究報道。本實驗擬研究FDP對高脂飼料加小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)復(fù)制的T2DM大鼠模型腎臟功能蛋白的保護作用,并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 器材與動物

FDP注射液(山東新華制藥,批號：0711079),STZ、Na2ATP、哇巴因、膠原酶(Sigma公司),血糖測定儀(三諾,長沙),SOD、NOS檢測試劑盒(南京建成),[γ-32P]ATP(北京福瑞特公司),SN-6930A型液閃儀與SN-6100型γ計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)。雄性Wistar大鼠,一級,體質(zhì)量(195±16)g;高能飼料(60%常規(guī)飼料,20%蔗糖,15%豬油,5%膽固醇),均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供,動物合格證號：SCXK(川)2004-15。

1.2 動物模型建立與分組

T2DM大鼠模型的建立參照實驗室既往方法[2],4 w高能飼料喂養(yǎng),空腹12 h后給予 25 mg?kg-1的STZ一次性腹腔注射(STZ注射前用pH=4.2的檸檬酸緩沖液配成1%濃度),繼續(xù)高能飼料喂養(yǎng) 4 w,采尾靜脈血測定空腹血糖(FBG),以FBG≥7.8 mmol?L-1作為T2DM 模型判斷標(biāo)準(zhǔn),最后選取符合條件的16只大鼠作為T2DM模型(建模成功率70%),其余淘汰。實驗動物隨機分為3組(n=8)：正常對照組(A);模型對照組(B);FDP治療組(C)。治療組參照文獻(xiàn)用FDP 5ml?kg-1?d-1一次性腹腔注射治療[3],對照組每次等量生理鹽水處理,在FDP治療期間,全部大鼠都用常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水。實驗動物于FDP治療12 w末空腹12 h,1%戊巴比妥鈉30 mg?kg-1麻醉后從心臟采血制備血清標(biāo)本待測,然后摘取右側(cè)腎臟,去包膜后用濾紙吸干水分后稱重,將右腎質(zhì)量與體質(zhì)量之比(KW/BW)作為腎臟肥大指數(shù)[4]。左側(cè)腎臟于-70℃凍存用于近端腎小管的微分離及其管周膜上鈉泵活性的測定。

1.3 生化及放免檢測

血糖采用血糖儀測定,SOD和NOS的檢測嚴(yán)格按照說明書采用751分光光度計測定。

1.4 單根PT的獲取及其鈉泵活性測定[5]

將顯微微分離的單根PT經(jīng)過低滲凍融處理后,與1μ l總ATPase測定液或Mg-ATPase測定液37℃共同孵育15min,液閃儀測定孵育液中32Pi的每分鐘計數(shù)(cpm)值,利用Concet公式計算PT鈉泵活性,酶的活性單位用pmol?mm-1?h-1表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FDP對T2DM大鼠一般癥狀體征的影響

建立的T2DM模型大鼠與A組比較,體重明顯增加,并出現(xiàn)腹型肥胖和多飲,多食,多尿的癥狀,毛發(fā)色澤晦暗,精神萎靡,活動減少,隨著病程延長,除大鼠體重呈下降趨勢外,其它病理癥狀逐漸加重,B組中1只大鼠可能由于高血糖繼發(fā)酮癥酸中毒而死亡;C組與B組比較,12 w后大鼠上述癥狀與病理體征明顯改善。

2.2 FDP對T2DM大鼠生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的影響

表1可見,與A組比較,B組大鼠FBG水平與KW/BW顯著升高(P＜0.01),SOD、NOS水平顯著降低(P＜0.01);與 B組比較,FDP治療12 w后,C組大鼠FBG與KW/BW顯著降低(P＜0.01),SOD、NOS水平顯著升高(P＜0.01)。

表1 實驗大鼠血清生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的變化()

表1 實驗大鼠血清生化指標(biāo)和腎臟肥大指數(shù)的變化()

＊與A組比較P＜0.01,#與B組比較P＜0.01。

分組 A(8只) B(7只) C(8只)FBG(mmol? L-1) 5.08±0.46 13.35±3.42＊ 9.64±1.21#KW/BW(×10-3) 3.04±0.26 4.62±0.43＊ 3.65±0.32#SOD(U?ml-1) 120.28±13.30 85.53±9.82＊ 108.68±10.47#NOS(U?ml-1) 36.55±3.23 21.47±2.21＊ 31.54±3.12#

2.3 FDP對T2DM大鼠近端腎小管鈉泵活性的影響

如表2,與A組比較,B組大鼠12 w時PT鈉泵活性顯著降低(P＜0.01);與 B組比較,FDP治療12 w后,C組大鼠 PT鈉泵活性顯著升高(P＜0.01)。

表2 FDP對T2DM大鼠PT鈉泵活性的影響()

表2 FDP對T2DM大鼠PT鈉泵活性的影響()

＊與A組比較P＜0.01,#與B組比較P＜0.01。

分組 鈉泵活性(pmol?mm-1?h-1)A(8只) 1972±154 B(7只) 1163±105＊C(8只) 1785±126#

3 討論

糖尿病對腎臟的損害主要與持續(xù)高血糖和體內(nèi)氧化增強有關(guān),因為腎臟的微循環(huán)與腎小管長期直接處于高糖環(huán)境中,而且自身組織結(jié)構(gòu)薄弱,所以容易受到損害導(dǎo)致腎臟功能發(fā)生改變。實驗結(jié)果顯示T2DM大鼠建模12 w后,血糖水平與腎臟肥大顯著升高,而體內(nèi)抗氧化能力的兩個重要指標(biāo)SOD與NOS都顯著降低,一般癥狀與體征也明顯加重。

目前研究證實FDP是細(xì)胞內(nèi)糖代謝的重要中間產(chǎn)物,能夠調(diào)節(jié)許多代謝通路,外源性的FDP通過激活磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性,使細(xì)胞內(nèi)ATP濃度顯著增加,促進鉀離子內(nèi)流,有益于缺血、缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的能量代謝和葡萄糖的利用,從而降低血糖,保護細(xì)胞的功能。T2DM大鼠經(jīng)過FDP治療12 w后,血糖水平與腎臟肥大指數(shù)顯著降低,SOD與NOS顯著升高,糖尿病一般癥狀與體征亦明顯改善。有研究報道FDP能提高T2DM大鼠體內(nèi)的抗氧化應(yīng)急能力[6],其機制可能是通過增強細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,可以抑制局部組織及中性粒細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下氧自由基及組織胺等有害物質(zhì)的釋放,提高SOD活性,促進機體對氧自由基的清除,從而減輕組織的氧化損害。

目前臨床上一般通過檢測患者尿中微球蛋白作為診斷糖尿病腎病的重要依據(jù),但是當(dāng)尿中出現(xiàn)微球蛋白時,往往提示患者已進入糖尿病腎病晚期,本實驗通過檢測近端腎小管管周膜上鈉泵的活性,觀察糖尿病大鼠腎臟功能的早期損害及其FDP對腎臟功能的保護作用,發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠12 w時近端腎小管鈉泵活性顯著降低,表明此時糖尿病大鼠腎臟功能已經(jīng)受到損害,與模型對照組比較,FDP治療組大鼠近端腎小管鈉泵活性顯著升高,表明FDP不僅能夠抑制T2DM大鼠腎臟肥大,還能保護腎小管管周膜上的功能蛋白,這些作用可能與FDP能夠降低血液粘滯度,改善局部微循環(huán)狀態(tài)有關(guān)。

總之,FDP對糖尿病大鼠腎臟功能具有明顯的保護作用,其機制與可能FDP降低動物體內(nèi)血糖水平,改善腎臟微循環(huán)狀態(tài)和提高體內(nèi)抗氧化能力有關(guān)。

1 張惠榮,趙慧,趙莉莉,等.1,6二磷酸果糖治療新生兒缺氧缺血性腦病的臨床觀察[J].農(nóng)墾醫(yī)學(xué),2006,28(3)：182-184.

2 劉紅,羅蕾,高原.2型糖尿病大鼠近球小管 Na+,K+-AT Pase活性變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,28(20)：2062-2064.

3 薛瑞鳳,孫冬梅,郭淑香.果糖-1,6-二磷酸對糖尿病大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(7)：801-802.

4 趙煥新,高原.大鼠糖尿病早期腎臟皮質(zhì)Na+,K+-AT P酶α 1-亞單位的表達(dá)[J].四川生理科學(xué)雜志,2004,26(2)：58-60.

5 高原,羅蕾,劉紅.大鼠單根近端腎小管Na+-K+-ATPase活性測定方法的改進[J].生理學(xué)報,2007,59(3)：55-57.

6 李勇,施海明,奚悅文,等.果糖二磷酸鈉對冠心病心絞痛的療效及其脂質(zhì)過氧化抑制作用[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2001,8(3)：252-254.