孫遠征,衛(wèi)哲,馬俊,王明明

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

·動物實驗·

電針對嗎啡戒斷后焦慮大鼠行為和DA含量變化的影響

孫遠征1,衛(wèi)哲1,馬俊2,王明明2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

【摘要】目的觀察電針對嗎啡戒斷后焦慮SD大鼠的作用和相關(guān)腦區(qū)DA遞質(zhì)的影響。方法采用逐日遞增法,皮下注射嗎啡形成大鼠依賴后,注射納洛酮快速戒斷,建立嗎啡依賴戒斷模型。采用高架十字迷宮測定大鼠焦慮程度,觀察電針對腦內(nèi)DA神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。結(jié)果電針可顯著提高嗎啡戒斷后焦慮模型大鼠OE%、OT%值(P＜0.01);電針能降低嗎啡戒斷后SD大鼠腦組織的DA含量(P＜0.05)。結(jié)論電針可以改善嗎啡戒斷后大鼠的戒斷癥狀,抑制嗎啡戒斷后所致焦慮癥狀,其機制可能與電針調(diào)節(jié)嗎啡戒斷后大鼠腦內(nèi)DA含量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】電針;嗎啡戒斷;多巴胺;大鼠

嗎啡依賴在世界范圍的蔓延泛濫并成為世界性公害,給個人、家庭、社會帶來了巨大損害,戒毒治療已成為國內(nèi)外醫(yī)學界研究的熱點。中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)作為藥物成癮的神經(jīng)生物學基礎(chǔ),是目前公認的與成癮有關(guān)的最重要的腦區(qū)[1]。該系統(tǒng)起自中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(Ventral Tegmental Area,VTA)向伏隔核(Nucleus Accum-bens,NAc)的投射[2]。焦慮是對阿片類物質(zhì)依賴者所反映的重要戒斷癥狀。臨床研究已證實,針灸戒毒作為一種有效的治療手段,具有治療安全,無毒副反應(yīng),可抑制戒斷癥狀,易為患者接受等優(yōu)點,在全世界得到快速推廣[3]。電針可以改善戒斷癥狀,目前多為電針治療單一穴位對嗎啡戒斷后癥狀的研究。本研究通過建立嗎啡戒斷后大鼠模型,優(yōu)化穴位選擇,觀察電針對嗎啡戒斷后焦慮大鼠的影響,進一步探討電針治療嗎啡戒斷后的中樞作用機制。

1　材料與方法

1.1研究對象

選用SD大鼠50只,雄性,體重180～220 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。動物在實驗前馴養(yǎng)1周,動物房溫度、濕度分別維持在20℃、70%左右。

1.2試劑與儀器

鹽酸嗎啡注射液(morphine hydrochloride)由沈陽第一制藥廠提供;鹽酸納絡(luò)酮注射液(naloxone, NLX)由成都倍特藥業(yè)有限公司提供;DA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D);戊二醛(上海生物工程有限公司);多聚甲醛(分析純,上海溶劑廠);酶標儀、高架十字迷宮、KWD808Ⅱ脈沖治療儀。

1.3造模方法

參照文獻[4]進行造模,建立嗎啡戒斷后大鼠模型。采用逐日遞增法背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液(20 mg /kg,30 mg/kg,40 mg/kg,50 mg/kg),2次/d (8 am,4 pm),連續(xù)5 d。于末次注射嗎啡后3 h給予納絡(luò)酮腹腔注射(3 mg/kg)快速戒斷,隨即將大鼠置于3000 mL燒杯中,觀察10 min內(nèi)大鼠的跳躍、舔陰、豎立、濕抖、洗臉等戒斷反應(yīng),將嗎啡依賴戒斷大鼠作為模型動物。戒斷反應(yīng)觀察參照Maldonade等的方法,觀察濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎、腹瀉等戒斷癥狀,根據(jù)其評分標準進行評分,記錄可數(shù)癥狀在觀察時間內(nèi)發(fā)生的次數(shù),按戒斷癥狀評分標準進行評分。不可數(shù)癥狀包括上瞼下垂、流涎、腹瀉。2 min評定1次上瞼下垂,其他不可數(shù)癥狀按嚴重程度進行評分,無癥狀評為 0分,輕度1分,嚴重2分。全部癥狀得分之和為戒斷總分。詳見表1。

表1　戒斷癥狀評分標準

1.4動物分組與處理

將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、電針組和手針組,每組10只,共40只。各組相同時間、相同方法注射生理鹽水,連續(xù)5 d,2次/d,第6天催癮后開始同模針組相同方法固定;模型組按上述方法造模,第6天催癮后開始同模針組相同方法固定;電針組第 6天催癮后開始予電針治療,按照《中國獸醫(yī)針灸學》及《實驗針灸學》取百會、雙側(cè)腎俞、三陰交、足三里穴,接電針治療儀(疏密波,頻率 2/ 100 Hz),以小鼠下肢針刺側(cè)輕微抖動為度,15 min/次,1次/d,連續(xù)治療6 d;手針組第 6天催癮后開始予針刺治療,取穴方法同電針組,得氣后留針15 min。

1.5高架十字迷宮實驗

治療結(jié)束后采用高架十字迷宮自動錄像監(jiān)測系統(tǒng)觀測動物活動情況。每只動物測試5 min,各組同步交替進行。具體方法為,測試前將每只小鼠依次放入60 cm×60 cm×35 cm塑料盒中,盒底顏色、質(zhì)地與迷宮一致。待小鼠適應(yīng)5 min后,輕柔抓起并置于迷宮中央?yún)^(qū),使其頭部正對一個開臂,隨即記錄5 min內(nèi)小鼠分別進入開臂與閉臂的次數(shù)和滯留時間,計算各組小鼠在開臂滯留時間(Open-arms Time,OT)和進入開臂次數(shù)(Open-arms Entries,OE)分別占兩臂滯留總時間和進入兩臂總次數(shù)的百分比(OE%和 OT%),以小鼠四爪均進入開臂或閉臂為進臂一次的標準[5]。

1.6灌注取材

各實驗組大鼠治療結(jié)束后第二天,腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg),麻醉后開胸,于右心房和左心室心尖部各做一切口,進行主動脈插管快速灌注沖洗液200～250 mL(每 100 mL含氯化鈉 0.85 g,氯化鉀0.025 g,碳酸氫鈉0.02 g),隨后用300 mL含0.5%戊二醛、4%多聚甲醛和 0.l mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)的固定液進行灌注固定,開顱,完整取出全腦組織,分離VTA、NAc,部分置入上述固定液中固定過夜。

1.7ELISA法檢測大鼠腦區(qū)DA含量

取液氮中凍存的VTA和NAc腦區(qū),每例取腦組織0.1 g,用生理鹽水制成10%的組織勻漿備用,具體操作按ELISA試劑盒說明書進行。測定每升腦組織勻漿中DA的量,單位為mmol/L。

1.8統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均由SPSS統(tǒng)計軟件處理。采用單因素方差分析、q檢驗。數(shù)據(jù)以±s表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀比較

在實驗中觀察到,除空白組外,其余各組大鼠經(jīng)納洛酮催促后出現(xiàn)站立、激惹、齒顫、濕狗樣顫抖、煩躁不安、上瞼下垂、跳躍、清理皮毛等戒斷癥狀,模型組、電針組和手針組與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),而空白組無明顯戒斷癥狀,說明動物模型建立成功。詳見表2。

表2　各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀比較　(±s,分)

表2　各組嗎啡依賴大鼠戒斷癥狀比較　(±s,分)

注:與空白組比較1)P＜0.01

組別 　n 　戒斷癥狀評分值空白組 　10 　0.3±0.48模型組 　10 　20.5±4.161)電針組 　10 　19.4±4.921)手針組 　10 　20.6±6.811)

2.2各組大鼠高架十字迷宮測試結(jié)果比較

模型組 OT%、OE%值與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);電針組OT%、OE%值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);手針組OT%、OE%值與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果表明,嗎啡戒斷后大鼠出現(xiàn)明顯的焦慮狀態(tài),造模成功;針灸可以減輕嗎啡戒斷后模型大鼠焦慮情緒,電針組療效顯著。詳見表3。

表3　各組大鼠高架十字迷宮測試結(jié)果比較　(±s)

表3　各組大鼠高架十字迷宮測試結(jié)果比較　(±s)

注:與空白組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01,3)P＜0.05

組別 　n 　OT% 　OE%空白組 　10 　58.32±14.23 　59.64±7.58模型組 　10 　22.74±16.901)　28.49±19.231)電針組 　10 　46.78±10.702)　49.36±11.542)手針組 　10 　38.15±10.343)　42.69±9.433)

2.3各組大鼠腦區(qū)DA含量比較

采用ELISA法測定各組大鼠相關(guān)腦區(qū)DA含量的變化。模型組、電針組和手針組的 VTA和NAc腦區(qū)DA含量與空白組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。電針組、手針組的VTA和NAc腦區(qū)DA含量與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),提示針灸可以降低嗎啡戒斷后大鼠腦區(qū) DA含量,以降低NAc的DA含量為主。詳見表4。

表4　各組大鼠腦區(qū)DA含量比較　(±s,ng/L)

表4　各組大鼠腦區(qū)DA含量比較　(±s,ng/L)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 　n 　VTA 　NAc空白組 　10 　403.13±34.25 　382.18±20.56模型組 　10 　649.78±47.451)　639.73±28.671)電針組 　10 　489.34±27.451)2)　439.3±23.571)2)手針組 　10 　538.65±41.681)2)　497.32±31.681)2)

3　討論

復吸是藥物成癮的共同特征,藥物成癮后的戒斷癥狀導致復吸率長期居高不下,中醫(yī)藥戒毒方法已經(jīng)日益受到重視,針灸治療藥物成癮后戒斷綜合征取得了一定的療效[6]。阿片使用后中腦邊緣DA系統(tǒng)功能的改變一直是阿片依賴及戒斷形成機制的重點。本實驗以逐日遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型,腹腔注射納洛酮催促戒斷后,通過戒斷癥狀評分確立嗎啡依賴后戒斷大鼠模型。結(jié)果顯示,電針可以顯著提高嗎啡戒斷后焦慮模型大鼠的 OE%、OT%值(P＜0.01)。電針組、手針組與模型組相比,可以降低嗎啡戒斷后大鼠相關(guān)腦區(qū)DA含量(P＜0.05),以電針組為著。結(jié)果表明,電針可以減輕嗎啡戒斷后大鼠焦慮狀態(tài),其機制可能與電針調(diào)節(jié)嗎啡戒斷后大鼠腦內(nèi)DA的釋放有關(guān)。

阿片類物質(zhì)成癮后戒斷綜合征主要以肝、脾、腎三臟陰液不足陰虛火旺為根本病機改變[7]。而在戒斷癥狀中出現(xiàn)率最高的焦躁不安、失眠、渴求藥物及自汗,多屬陰陽兩虛或氣陰兩虛而以陽虛或氣虛為主要表現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)[8],不同頻率電針可以釋放中樞不同種類的神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)。本實驗選取高頻與低頻交替的疏密波(2/100 Hz),對于身體依賴和精神依賴均有確切的治療作用。以往研究發(fā)現(xiàn)[9],電針“足三里”穴可以使嗎啡戒斷大鼠β-EP含量增加,提高機體免疫功能。針刺“三陰交”穴可以降低嗎啡戒斷大鼠腦內(nèi)NE含量[10]。艾灸關(guān)元可促進嗎啡依賴小鼠體質(zhì)量增加,淋巴細胞轉(zhuǎn)化增強,提高免疫功能[11]。本研究根據(jù)經(jīng)絡(luò)穴位特性,選取百會、腎俞、足三里、三陰交穴,各穴位聯(lián)合應(yīng)用能激發(fā)經(jīng)氣,促使氣血周身流動,理氣清熱化痰,開竅醒神,滋陰溫陽,使失調(diào)的陰陽趨于平衡,可以更好地改善戒斷綜合征的病機變化,緩解戒斷癥狀。

針灸在促進脫毒上具有很大的應(yīng)用潛力和前景,值得進一步關(guān)注與研究。本實驗初步分析電針對嗎啡戒斷后焦慮大鼠的影響,其改善焦慮的作用可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)DA神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān),但目前尚缺乏實驗的大樣本研究,并且同時應(yīng)該加強穴位配伍、針刺手法等方面的深入研究,進一步探討針灸防復吸的中樞作用機制,從而充分發(fā)揮中醫(yī)藥戒毒優(yōu)勢。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI:10.3969/j.issn.1005-0957.2011.05.337

文章編號:1005-0957(2011)05-0337-03

收稿日期2010-07-21

作者簡介:孫遠征(1957 - ),男,主任醫(yī)師

Effect of Electroacupuncture on Behavior and DA Content in Rats with Morphine Withdrawal-induced Anxiety

SUN Yuan-zheng1, WEI Zhe1, MA Jun2, WANG Ming-ming2.1.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Helongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture on behavior and correlative brain area neurotransmitter DA in rats with morphine withdrawal-induced anxiety.MethodsA rat model of morphine addiction and withdrawal was made by daily subcutaneous injections of increasing morphine for morphinism and subsequent naloxone injections for rapid withdrawal. Rat anxiety severity was assessed using an elevated cross maze. The effect of electroacupuncture on brain neurotransmitter DA content was observed.ResultsElectroacupuncture significantly increased OE% and OT% values (P＜0.01) and decreased the brain DA content (P＜0.05) in the rats with morphine withdrawal-induced anxiety. ConclusionElectroacupuncture can improve withdrawal symptoms and relieve withdrawal anxiety in morphine withdrawal rats. The mechanism may be related to electroacupuncture regulating the brain DA content in morphine withdrawal rats.

[Key words]Electroacupuncture; Morphine withdrawal; Dopamine; Rat