朱平軍,程茂基,江 濤,邱良偉,關(guān)嬌嬌
(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,合肥 230036)
發(fā)酵豆粕是一種新型植物蛋白飼料原料,其以豆粕為主要原料,運(yùn)用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)而成,與豆粕相比,發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平大為降低,營養(yǎng)水平和使用價(jià)值得到提高,應(yīng)用范圍也更加廣泛[1]。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中,常使用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、黑曲霉和米曲霉菌等一種或數(shù)種微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵,其中黑曲霉因?yàn)槠洫?dú)特的性質(zhì)而受到特別青睞。黑曲霉具有產(chǎn)酶能力強(qiáng)、酶系豐富等特點(diǎn),可以分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶,是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)允許應(yīng)用在飼料中的益生菌之一[2-3]。
發(fā)酵豆粕質(zhì)量檢測(cè)的指標(biāo)包括感官指標(biāo)、常規(guī)指標(biāo)(灰分、氨基酸)、抗?fàn)I養(yǎng)因子去除程度和小分子蛋白的含量等。本試驗(yàn)使用黑曲霉發(fā)酵豆粕,利用黑曲霉產(chǎn)生的蛋白酶等消化酶降解豆粕中的蛋白質(zhì),使豆粕大分子蛋白降解為小分子蛋白、肽類和氨基酸等。為簡單起見,本試驗(yàn)以黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量作為試驗(yàn)測(cè)定指標(biāo)。
黑曲霉益生菌株AN03為本實(shí)驗(yàn)室選育保存(N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株)。
斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為土豆培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基不加瓊脂。
豆粕購自合肥市場(chǎng)。
從新鮮黑曲霉斜面中挑取一環(huán)菌,接入裝有50mL液體土豆培養(yǎng)基和數(shù)粒玻璃珠的三角瓶中,120 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。
參照大豆肽粉標(biāo)準(zhǔn)(QB/T 2653-2004)中酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g,加入15%三氯乙酸(TCA)溶液10mL,混合均勻,靜置5min。將溶液定量轉(zhuǎn)移,在4 000 rpm下離心10min后,取全部上清液,按GB/T 14771-1993規(guī)定的方法測(cè)定上清液可溶蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25,測(cè)定結(jié)果根據(jù)樣品的干燥失重,折算為干基。
2.2.1 發(fā)酵時(shí)間
取30 g豆粕于自封袋中(開口發(fā)酵,下同),發(fā)酵溫度28℃,接種量6%,料水比1∶1,置于振蕩培養(yǎng)箱中,研究發(fā)酵時(shí)間0、24、48、72、96和120 h對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量的影響。試驗(yàn)分為6組,每組2個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)2袋,下同。
2.2.2 發(fā)酵溫度
取30 g豆粕于自封袋中,發(fā)酵時(shí)間72 h,接種量6%,料水比1:1,置于振蕩培養(yǎng)箱中,研究發(fā)酵溫度26、27、28、29、30和31℃對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量的影響。
2.2.3 接種量
取30 g豆粕于自封袋中,發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度28℃,料水比1∶1,置于振蕩培養(yǎng)箱中,研究接種量2%、4%、6%、8%、10%和12%對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量的影響。
2.2.4 料水比
取30 g豆粕于自封袋中,發(fā)酵時(shí)間72 h,發(fā)酵溫度28℃,接種量6%,置于振蕩培養(yǎng)箱中,研究料水比1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1和1∶1.1對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量的影響。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取單因素中對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響較大的試驗(yàn)條件進(jìn)行正交試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵豆粕的發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)每組設(shè)2個(gè)重復(fù)。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用正交設(shè)計(jì)助手和SAS 9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤標(biāo)示。
3.1.1 發(fā)酵時(shí)間
發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表1。
表1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%
由表1可見,未發(fā)酵豆粕原料中酸溶蛋白含量僅有1.75%,黑曲霉發(fā)酵24 h后發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量就達(dá)到9.63%,發(fā)酵96 h含量最高可達(dá)11.59%,隨發(fā)酵時(shí)間的延長酸溶蛋白含量又開始下降,原因是達(dá)到酸溶蛋白含量最高以后,發(fā)酵時(shí)間再延長,黑曲霉就會(huì)把先前降解成的肽類和氨基酸等繼續(xù)降解為氨等揮發(fā)掉,致使發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量下降。
3.1.2 發(fā)酵溫度
發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表2。
由表2可見,隨著發(fā)酵溫度的升高,產(chǎn)品中酸溶蛋白的含量先是逐漸上升,而后又逐漸降低,這是因?yàn)槌跏紲囟鹊陀诤谇巩a(chǎn)酶的最適溫度,從低溫到最適產(chǎn)酶溫度黑曲霉產(chǎn)酶量會(huì)逐漸增加,所以酸溶蛋白含量也隨溫度升高而上升。隨后溫度提高致黑曲霉生長速度加快,產(chǎn)生大量孢子,反而不利于產(chǎn)酶,所以達(dá)最適產(chǎn)酶溫度后,再提高溫度高反而致酸溶蛋白含量降低。
3.1.3 接種量
接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表3。
表2 發(fā)酵溫度對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%
表3 接種量對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%
由表3可見,發(fā)酵后酸溶蛋白質(zhì)含量隨接種量的提高而逐漸上升,達(dá)一定程度后又開始下降,原因可能是接種量達(dá)一定比例后,發(fā)酵底物豆粕中微生物會(huì)達(dá)到飽和,相互競(jìng)爭底物,競(jìng)爭的結(jié)果反而不利于部分發(fā)酵微生物的生存。
3.1.4 料水比
料水比對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表4。
由表4可見,料水比約為1∶0.9,發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量最高,這是因?yàn)榘l(fā)酵微生物生長需要一定含量的水分,料水比低,發(fā)酵料中水分就供應(yīng)不足,使微生物生長受到抑制,不利于產(chǎn)酶,從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量低。相反,料水比高,發(fā)酵料過濕,就會(huì)影響發(fā)酵原料的透氣性,同樣使黑曲霉生長受到抑制。
表4 料水比對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量和料水比,做L9(34)正交優(yōu)化試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表5~6。
表5 正交試驗(yàn)L9(34)因素水平
由表6直觀分析表明,影響黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量的4個(gè)因素的主次順序依次是:時(shí)間>溫度>料水比>接種量,理論上酸溶蛋白含量最高的組合是A2B2C1D2,即發(fā)酵時(shí)間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。
表6 正交試驗(yàn)L9(34)直觀分析
由表6正交試驗(yàn)方差分析表明,發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度分別對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量有極顯著影響和顯著影響。
因正交試驗(yàn)中未包含最佳發(fā)酵組合A2B2C1D2,根據(jù)理論最佳發(fā)酵組合條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),發(fā)酵后測(cè)得發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量平均為13.62%,含量高于正交試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組合。所以A2B2C1D2是本試驗(yàn)的最佳發(fā)酵組合條件,即發(fā)酵時(shí)間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。
應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)處理豆粕,是有效提高豆粕品質(zhì)的方法之一,在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生可以直接被動(dòng)物吸收的小肽和其他多種生物活性物質(zhì),這對(duì)動(dòng)物的生長十分有利[4]。小分子蛋白含量是衡量發(fā)酵豆粕質(zhì)量的主要指標(biāo)之一,我國企業(yè)常使用三氯乙酸酸溶蛋白作為發(fā)酵豆粕中小分子蛋白含量的常規(guī)檢測(cè)方法。
黑曲霉發(fā)酵豆粕能提高豆粕中酸溶蛋白的含量,主要是由于黑曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性蛋白酶、纖維素酶等消化酶對(duì)豆粕原料進(jìn)行消化的結(jié)果,所以在試驗(yàn)中影響消化酶產(chǎn)量和消化酶活力的因素均可能對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)所用黑曲霉菌株是經(jīng)過N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株,不僅具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸性蛋白酶的能力,而且還具有很強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶和果膠酶的能力[5]。另外,黑曲霉產(chǎn)生的酸性蛋白酶主要是端肽酶(如天冬氨酸蛋白酶),端肽酶能從大豆蛋白肽鏈的末端開始水解,特異性地切斷疏水性多肽末端的兩種疏水性氨基酸,使大分子蛋白被切成數(shù)段的小分子,即大豆肽。Yoshitsugu等研究發(fā)現(xiàn),酸性蛋白酶酶解的產(chǎn)物主要是相對(duì)分子質(zhì)量為300~600的小肽,酸性羧肽酶的酶解產(chǎn)物主要是相對(duì)分子質(zhì)量為200~400的小肽[6]。由于黑曲霉還能分泌的纖維素酶、果膠酶等消化酶,這些消化酶能破壞植物原料細(xì)胞壁,促使細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來,利于酸性蛋白酶與大分子蛋白充分接觸,大分子蛋白被降解為小分子蛋白。衛(wèi)琳等用黑曲霉AS3.350固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽,研究得到最佳工藝條件為發(fā)酵料坯中豆粕含量為87%、pH 5.8、發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間為90 h,在該條件下發(fā)酵豆粕中大豆肽的轉(zhuǎn)化率為62.35%[7]。秦衛(wèi)東等在用黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在接種量為2%、發(fā)酵液pH 6.0、底物質(zhì)量濃度9 g·100mL-1、發(fā)酵時(shí)間34 h的條件下,所得發(fā)酵液中豆粕多肽的質(zhì)量濃度最高,為3.38mg·mL-1[8]。由以上試驗(yàn)可以看出,上述黑曲霉發(fā)酵豆粕試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果具有一致性,即黑曲霉發(fā)酵豆粕能提高產(chǎn)品中小分子蛋白的含量。嚴(yán)鶴松通過對(duì)影響黑曲霉發(fā)酵豆粕進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,最佳的發(fā)酵工藝條件為接種量0.5%、料水比1∶1、發(fā)酵時(shí)間3 d、溫度35℃、裝料量20 g(直徑7 cm×高8 cm罐頭瓶中)[9]。
本試驗(yàn)表明,發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度是影響黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量的主要因素,經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化與分析得到最佳發(fā)酵工藝條件,即發(fā)酵時(shí)間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。黑曲霉發(fā)酵豆粕能明顯提高豆粕中的酸溶蛋白含量,提高豆粕的營養(yǎng)水平,酸溶蛋白含量由發(fā)酵前的1.75%提高到13.62%。
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