駱 俊,韓金蓉,王 艷柯 林,楊 敏,費永俊 長江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025

牡丹 (Paeonia suf f ruticosa)屬芍藥科芍藥屬,多年生木本落葉灌木,是我國特有的觀賞植物種質(zhì)資源,具有重要的觀賞、食用、藥用及工業(yè)價值[1]。近十余年,國內(nèi)外展開了對牡丹的系統(tǒng)研究,主要集中在資源的調(diào)查、品種分類、引種栽培、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、生理等方面。生理方面的研究主要集中在花期調(diào)控、切花采后生理和貯藏保鮮[2～6],但關(guān)于牡丹抗高溫脅迫耐性方面的報道很少。本研究通過研究高溫脅迫下牡丹葉片電解質(zhì)滲透率、游離脯氨酸 (Pro)含量、丙二醛 (MDA)含量和過氧化物酶 (POD)活性等抗性生理指標(biāo)的變化,研究牡丹抗脅迫的形式、途徑和大小及抗性機(jī)制,初步探討牡丹高溫脅迫下的傷害與適應(yīng)等抗性生理變化,以更好地開發(fā)利用牡丹資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材取自于植物園內(nèi)種植的一年生牡丹幼苗,種源采自湖北五峰縣野生牡丹,已在長江大學(xué)植物園馴化栽培8 a,能正常開花結(jié)實。于2009年9月3日選取牡丹幼苗移栽入花盆,栽培基質(zhì)配方為蛭石∶珍珠巖∶泥炭土∶陶粒=3∶1∶4∶1。

1.2 試驗處理

選取生長勢一致的盆栽牡丹置于人工氣候箱內(nèi),分別對牡丹進(jìn)行不同模擬高溫處理,設(shè)置30、35、40℃3個溫度,并以25℃為對照;每種方式處理3盆,處理過程中氣候箱內(nèi)空氣濕度為80%,光照強(qiáng)度為4 000 lx,每天光照12 h,連續(xù)處理2 d。處理后立即從各苗木基部采取3片葉片進(jìn)行測定,每個指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.3 指標(biāo)測定方法

(1)電解質(zhì)滲透率測定 準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉樣0.2 g,分別置于燒杯中,加蒸餾水10 mL,在25℃下浸提30 min后,采用DDS-11A型電導(dǎo)儀分別測定電導(dǎo)率 (C1),再置于沸水浴中10 min,冷卻后分別測定煮沸電導(dǎo)率 (C2),然后采用公式電解質(zhì)滲透率=(C1/C2)×100%[7]分別計算電解質(zhì)滲透率。

(2)游離脯氨酸含量測定 準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉樣各0.2 g,分別置入大試管中,分別加入3%的磺基水楊酸溶液5 mL,在沸水浴中提取10 min(提取過程中要經(jīng)常搖動),冷卻后過濾于干凈的試管中,濾液即為脯氨酸的提取液。吸取提取液2 mL于另一干凈的帶玻塞試管中,加入冰醋酸2 mL及酸性茚三酮試劑2 mL,在沸水浴中加熱30 min,溶液即呈紅色。冷卻后加入甲苯4 mL,搖蕩30 s,靜置片刻,取上層液至10 mL離心管中,在3 000 r/min下離心5 min。然后用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中,以甲苯為空白對照,在分光光度計上520 nm波長處比色,測得光密度值X,再根據(jù)公式單位鮮重樣品的脯氨酸含量=X×2.5/樣重[7]計算出脯氨酸含量。

(3)MDA含量的測定 準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.2 g,加入5%TCA 5 mL和少量石英砂,研磨成勻漿,勻漿在3 000 r/min離心10 min,上清液為樣品提取液。吸取離心的上清液2 mL于另一干凈試管中,加入0.67%TBA溶液2 mL,混勻物于沸水浴中反應(yīng)30 min,迅速冷卻后再離心1次。取上清液于比色杯中,以清水為對照,在分光光度計上分別測定600、532、450 nm波長下的光密度。用公式 C2=6.45×(D532-D600)-0.56×D450計算MDA的濃度,然后用公式MDA含量(μ mol/g)=C2μ mol/L)×提取液體積 (mL)/植物組織鮮重 (g)計算MDA含量[7]。

(4)POD活性的測定 準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.2 g,加 20 mmol/L KH2PO42.5 mL于研體中研磨成漿,在4 000 r/min離心15 min,傾出上清液在冷處保存,殘渣再加KH2PO42.5 mL提取1次,合并2次的上清液,冷處保存?zhèn)溆?。取比色?只,1只加反應(yīng)混合液3 mL、KH2PO41 mL,另1只加3 mL反應(yīng)混合液、1 mL酶液,在470 nm處讀數(shù) (每分鐘1次)。以每分鐘光密度變化 (以每分鐘D470nm變化0.01為1個活力單位)表示酶活性大小[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下牡丹的形態(tài)變化

觀察發(fā)現(xiàn),牡丹在25℃條件下能正常生長,在35℃的高溫下處理48 h后,牡丹葉片出現(xiàn)輕微失水癥狀,葉片稍下垂;40℃高溫處理后葉片失水、葉片尖端和葉緣出現(xiàn)褐色焦枯色塊等癥狀。

2.2 高溫脅迫下牡丹的抗逆生理響應(yīng)

(1)高溫脅迫對牡丹電解質(zhì)滲透率的影響 如圖1所示,牡丹經(jīng)30、35、40℃高溫處理后,質(zhì)膜透性的變化較大,溫度越高質(zhì)膜透性越大,40℃與35、30、25℃有極顯著差異,35℃與30、25℃有顯著差異。說明高溫對牡丹葉片細(xì)胞的傷害是明顯的。

(2)高溫脅迫對牡丹MDA含量的影響 如圖2所示,隨著溫度的升高,MDA含量總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,各處理下的MDA含量均高于對照?？赡芨邷孛{迫初期使牡丹葉片內(nèi)的MDA含量增加,但35℃以上的高溫脅迫使牡丹的防御機(jī)能出現(xiàn)紊亂,又使MDA含量降低。牡丹各溫度處理下葉片中MDA含量均高于對照,說明高溫對細(xì)胞膜的破壞明顯。

(3)高溫脅迫對牡丹Pro含量的影響 圖3所示高溫30、35、40℃處理的 Pro含量分別是 0.013、0.0277、0.031 g鮮重,分別為對照的 39.78%、190.32%、240.86%,且40℃與35、30、25℃均有顯著差異,可見,高溫脅迫能引起Pro含量的變化,表明隨著逆境脅迫程度的增加,牡丹葉片中脯氨酸含量增多,因此,脯氨酸可作為牡丹抗逆性強(qiáng)弱的鑒定指標(biāo)。

圖1 高溫脅迫對牡丹電解質(zhì)滲透率的影響

圖2 高溫脅迫對牡丹MDA含量的影響

(4)高溫脅迫對牡丹過氧化物酶 (POD)活性的影響 圖4顯示出了經(jīng)寒熱脅迫后POD活性的變化情況,與25℃對照相比,40℃與35、30、25℃有極顯著性差異,35℃與30℃有極顯著性差異,30℃與25℃有顯著性差異,隨著脅迫溫度的升高,牡丹葉片中的POD活性變化總體呈先降后升的趨勢。

圖3 高溫脅迫對牡丹脯氨酸含量的影響

圖4 高溫脅迫對過氧化物酶(POD)活性的影響

2.3 Pro含量及其與電解質(zhì)滲透率的相關(guān)性

高溫脅迫傷害細(xì)胞膜,改變膜透性,使胞質(zhì)外滲量增加,電解質(zhì)滲透率高,而脯氨酸是一種植物滲透調(diào)節(jié)劑,其含量的增加有助于細(xì)胞持水和生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[8]。將測定的游離脯氨酸 (Pro)含量與電解質(zhì)滲透率作相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.985(表1)。

表1 牡丹生理指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)

2.4 POD活性與MDA的關(guān)系

POD是植物對膜脂過氧化作用酶促防御體系的重要保護(hù)酶之一,通常POD活性的增加趨勢與MDA含量增加的趨勢呈負(fù)相關(guān)[9,10]。由表1可見,POD活性與MDA含量呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.3357,達(dá)到顯著水平。

3 討論與結(jié)論

3.1 高溫脅迫與電解質(zhì)滲透率、游離脯氨酸 (Pro)的關(guān)系

生物膜在植物逆境脅迫研究中占有重要地位,在高溫脅迫下,植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的半透性逐步喪失,依賴于膜系統(tǒng)的代謝系統(tǒng)和信號傳遞系統(tǒng)發(fā)生紊亂。當(dāng)牡丹受到高溫脅迫時,電解質(zhì)滲透率都有所增加,并隨著高溫脅迫強(qiáng)度的增強(qiáng)而繼續(xù)增加。

逆境下植物葉片游離脯氨酸累積,一是因為葉片組織中多種酶活性降低,脯氨酸氧化受阻,造成游離脯氨酸積累;二是谷氨酸合成脯氨酸的速度增加。脯氨酸是一種植物滲透調(diào)節(jié)劑,可提高植物細(xì)胞原生質(zhì)滲透壓,防水分散失以及提高原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性,從而提高植物體抗性[11]。大量的研究結(jié)果表明,脯氨酸的積累與細(xì)胞的脫水有關(guān),由于脅迫引起脫水,因此發(fā)生脯氨酸的積累。它的積累除可起到滲透調(diào)節(jié)外,更重要的是對膜脂和蛋白起到保護(hù)作用,防止活性氧對膜脂和蛋白的過氧化作用[12]。由此可以認(rèn)為高溫脅迫下牡丹葉片內(nèi)脯氨酸的升高也有助于提高它的抗性。

在逆境下植物體內(nèi)常有游離脯氨酸的積累,其積累量與逆境水平和植物對這種逆境的抗性有關(guān),因而測定植物體內(nèi)游離脯氨酸含量在一定程度上可以了解植株遭受逆境的情況及植物對逆境的抵抗能力。從本研究結(jié)果來看,隨著高溫程度的加劇,牡丹葉片游離脯氨酸的累積隨高溫時間呈指數(shù)上升趨勢,而且品種與品種之間表現(xiàn)出明顯的差異。連續(xù)高溫使植株受損傷的程度大,體內(nèi)游離脯氨酸積累量大。因此,游離脯氨酸可作為牡丹高溫脅迫的可靠指標(biāo)。

3.2 高溫脅迫與過氧化物酶 (POD)的關(guān)系

POD是膜保護(hù)系統(tǒng)的組成成分之一,能在逆境中清除植物體內(nèi)的活性氧,維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡,保護(hù)膜結(jié)構(gòu),減輕有毒物質(zhì)對活細(xì)胞的毒害,延遲和阻止細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞,使組織保持活力,從而使植物在一定程度上忍耐抵抗高溫逆境脅迫。圖4所示,溫度由25℃升至35℃時,酶活性緩慢下降,溫度繼續(xù)升高時,酶活性顯著上升。表明POD對環(huán)境條件的變化敏感,高溫脅迫時POD活性降低,可能是高溫脅迫打亂了植物正常的生理機(jī)能,暫時的不適應(yīng)導(dǎo)致了POD的合成受阻,一段時間后,它們又開始積極的防御反應(yīng)。

3.3 高溫脅迫與丙二醛 (MDA)含量的關(guān)系

MDA是高活性的脂過氧化物,能交聯(lián)脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì),在細(xì)胞中的積累具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,常導(dǎo)致質(zhì)膜傷害。葉片中MDA含量的多少可以代表膜損傷程度的大小。由于高溫脅迫,植物器官衰老或受到傷害,細(xì)胞往往發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用,丙二醛是膜質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物,細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞,從而導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生,活性氧的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用,造成細(xì)胞系統(tǒng)的損傷,因而作為膜脂過氧化產(chǎn)物,MDA含量的變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志之一。因此MDA含量可以反映植物遭受高溫脅迫傷害的程度。

3.4 高溫脅迫下POD活性與MDA含量的關(guān)系

POD活性與MDA含量成顯著負(fù)相關(guān) (表1),這種現(xiàn)象一方面是牡丹在高溫脅迫下活性氧累積加劇了膜脂過氧化作用,導(dǎo)致體內(nèi)MDA的積累,而MDA積累量還未達(dá)到能反過來抑制POD等保護(hù)酶的活性的程度,即活性氧的積累水平還處在膜脂過氧化作用酶促和非酶促防御體系所能調(diào)控的閾值范圍內(nèi)[13,14]。另一方面與牡丹葉片POD在高溫脅迫中反應(yīng)的復(fù)雜性和作用的非專一性有關(guān)。

4 結(jié)論

正常情況下,植物體內(nèi)各項代謝的生理生化過程都是比較穩(wěn)定而協(xié)調(diào)的,當(dāng)植物受到逆境脅迫時,植物體內(nèi)的各種代謝活動都會由于某種因素的影響而失調(diào),使植物對逆境作出反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,當(dāng)牡丹開始受到高溫脅迫時,牡丹葉片的電導(dǎo)率增大,游離脯氨酸大量累積,過氧化物酶活性升高,牡丹能正常生長,這說明牡丹具有一定的抗熱性,即能通過一系列保護(hù)性的生理生化反應(yīng)來適應(yīng)高溫脅迫,以減輕傷害;但隨著脅迫溫度的增強(qiáng),牡丹的外部形態(tài)和生理變化較大。

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