孫堯，李文博，程燕，宋博毅

糖尿病心肌病變是糖尿病患者主要的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致其死亡的主重要原因，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者心肌病變較非糖尿病患者高2～3倍［1］。心肌細胞凋亡在糖尿病心肌損害的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用［2］，糖尿病時，心肌細胞能量代謝紊亂，功能改變，凋亡增加，心肌細胞凋亡與高血壓、心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］，所以減少心肌細胞凋亡，保護心肌細胞數(shù)量，改善糖尿病患者的預(yù)后成為眾多學者研究的熱點。近年來有研究顯示纈沙坦除了能夠有效降血壓外，對糖尿病患者心肌也起到保護作用，但是其在抑制糖尿病心肌細胞凋亡方面的研究甚少。本實驗以鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立糖尿病大鼠模型，觀察Caspase-3和NF-κB在糖尿病大鼠心肌細胞中的表達，探討纈沙坦通過抑制糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡對糖尿病大鼠心肌的保護作用和可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 實驗動物為雄性SD大鼠29只(由河北聯(lián)合大學動物實驗中心提供)，體重(200±20)g。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取8只作為對照組(CN組)，以普通飼料喂養(yǎng)，自由進食水，余21只大鼠作為實驗組，以高糖高脂飲食(10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇、1%膽酸鈉、67%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)，4周后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg;1 g STZ溶于100 ml檸檬酸鹽緩沖液配制而成，pH 4.5)，CN組大鼠注射同等體積的檸檬酸鹽緩沖液，每隔4 d注射1次，共注射3次，于最后一次注射STZ 72 h后禁食12 h，取大鼠尾靜脈血測定血糖濃度，將血糖測定結(jié)果大于16.7 mmol/L視為2型糖尿病造模成功［4］。其中有19只大鼠造模成功，將其隨機分為糖尿病組(DM組，9只)和纈沙坦組(VAL組，10只)。VAL組大鼠給予纈沙坦(20 mg/kg·d)灌胃6周，而CN組和DM組大鼠每日給予同量蒸餾水灌胃。共有25只大鼠完成實驗，其中CN組8只，DM組7只，VAL組10只，2只大鼠死于糖尿病并發(fā)癥。

1.2 主要試劑 Caspase-3多克隆抗體、NF-κB多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);PV6001試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB底物顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);胰島素放射免疫分析藥盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號:1606-0606);TUNEL試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);纈沙坦(北京諾華公司)。

1.3 組織標本獲取 大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mg/kg)麻醉，打開腹腔取腹腔動脈血以檢測血糖、血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、胰島素抵抗指數(shù)以及胰島素水平。而后打開胸腔，迅速取出心臟，以冰鹽水沖洗，切取垂直于心臟左室長軸對稱中點上下左室截面，厚度為2～3 mm，放入10%中性甲醛內(nèi)，24 h后石蠟包埋。

1.4 血液指標檢測 收集的血液標本，采用唐博士血糖儀及唐博士血糖試紙檢測大鼠血糖，并記錄血糖值;采用放射免疫法檢測胰島素水平，用公式胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5計算胰島素抵抗指數(shù);采用酶比色法檢測TC、TG，測量結(jié)果均按照說明計算。

1.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 ①標本處理:將左室前壁心肌組織常規(guī)石蠟切片，置于二甲苯中脫蠟30 min，梯度乙醇水化，PBS洗滌2次，蛋白酶K室溫孵育，PBS洗滌2次，加入50 μl轉(zhuǎn)化劑POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入50～100 μl DAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，蘇木素復(fù)染細胞核，封片。②結(jié)果觀察:在Olympus顯微鏡下觀察，測微網(wǎng)格置于目鏡內(nèi)，將病變區(qū)置于高倍鏡(×400)下隨機選擇10個獨立視野，每個視野下選100個細胞，統(tǒng)計出凋亡細胞數(shù)。以胞核中見到棕黃色和棕褐色顆粒為陽性細胞。

1.6 免疫組化染色 將左室前壁心肌組織常規(guī)石蠟切片，滴加第一抗體，4℃過夜，0.1M PBS洗5 min×3次;滴加生物素化第二抗體(IgG)，37℃ 20 min，0.1M PBS洗5 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃ 20 min，0.1M PBS 洗5 min×3次;使用DAB顯色試劑盒1ml蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗;蘇木素復(fù)染細胞核1 min，充分水洗、1%鹽酸酒精分化、1%胺水反藍、充分水洗、經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min兩次、95%乙醇5 min兩次、100%乙醇5 min兩次脫水、二甲苯透明5 min兩次、中性樹脂封片。高倍鏡(×400)下每張切片選取5個視野，分析Caspase-3的表達情況，取平均值。以看到棕黃色或棕褐色為陽性表達。

1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，三組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況和生化指標觀察 正常對照組和高脂高糖組喂養(yǎng)的大鼠精神活躍，動作靈活，毛色有光澤，生長速度較快，高脂高糖組大鼠體重增加速度明顯快于正常對照組，27只大鼠無死亡。注射鏈脲佐菌素后大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多食、體重減輕的癥狀，血糖水平升高(P＜0.05)、胰島素水平降低(P＜0.05)，總膽固醇、甘油三酯水平增高(P ＜0.05)，纈沙坦治療組與糖尿病組比較，多飲多食、體重減輕情況減輕，血糖、胰島素水平、總膽固醇、甘油三酯水平無明顯變化(P＞0.05)(表1)。

2.2 TUNEL及免疫組化檢測 心肌細胞凋亡檢測可見，CN組TUNEL陽性細胞很少，與CN組相比DM組和VAL組TUNEL陽性細胞明顯增多;兩兩比較結(jié)果，DM組與CN組、VAL組與CN組之間均有差異(P均 ＜0.05)，而 VAL組和 DM組比較 TUNEL陽性細胞減少，差異具有顯著性(P＜0.05)。免疫組織化學染色分析可見:Caspase-3和NF-κB在DM組和VAL組中均高表達;DM組陽性表達率明顯高于CN組及VAL組，差異具統(tǒng)計學意義(P均 ＜0.05)(表1)。

3 討論

糖尿病是影響心功能的一個獨立危險因素，近年來在糖尿病心肌損害的研究中發(fā)現(xiàn)細胞凋亡參與糖尿病心肌病變，心肌細胞數(shù)量的降低可能是導(dǎo)致糖尿病心功能障礙的重要原因之一［5］。因此如何防止心肌細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，減少心肌細胞的丟失，改善糖尿病患者的預(yù)后成為眾多學者關(guān)注的熱點。本實驗以STZ建立糖尿病大鼠模型，TUNEL法觀測糖尿病大鼠左室心肌細胞凋亡情況，免疫組化法檢測Caspase-3和NF-κB在心肌中的表達，從而探討纈沙坦對糖尿病大鼠心肌細胞的保護作用及可能機制。

Caspase是一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路，Caspase如同凝血因子一樣“瀑布式”(cascade)層層激活，最終引發(fā)細胞凋亡［6］。Caspases-3在Caspase級聯(lián)反應(yīng)中處于核心位置，可被其上游信號激活，從而導(dǎo)致細胞凋亡。有研究顯示，Caspases-3是Fas介導(dǎo)細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)中的下游“核心”蛋白酶，AT1受體拮抗劑通過阻斷血管緊張素Ⅱ的作用抑制Fas的活性［9］，從而使Caspases-3介導(dǎo)的細胞凋亡受到抑制［7-8］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)與CN組相比，DM組Caspases-3陽性表達明顯增高，凋亡細胞顯著增加，應(yīng)用纈沙坦以后VAL組Caspases-3陽性表達明顯降低，凋亡細胞減少，表明Caspases-3可能參與糖尿病大鼠心肌細胞凋亡，纈沙坦可以抑制糖尿病大鼠的心肌細胞凋亡，其機制可能通過抑制血管緊張素Ⅱ的作用降低Fas的活性從而減少Caspases-3的表達，抑制心肌細胞的凋亡，保護心肌細胞。

表1 三組大鼠生化指標、心肌細胞TUNEL和免疫組化染色檢測(±s)

表1 三組大鼠生化指標、心肌細胞TUNEL和免疫組化染色檢測(±s)

注:與 CN 相比，aP＜0.05;與DM 組相比，bP ＜0.05

項目 CN組(n=8) DM組(n=7) VAL組(n=10)血糖(mmol/L) 5.09 ±0.15 21.61 ±1.9a 20.15 ±1.08a胰島素(μIU/ml) 28.46 ±1.06 22.17 ±1.41a 19.97 ±0.80a胰島素抵抗指數(shù) 6.54 ±0.31 21.33 ±2.77a 19.53 ±1.19a總膽固醇(mmol/L) 1.83 ±0.10 5.06 ±0.12a 4.71 ±0.24a甘油三酯(mmol/L) 1.76 ±0.11 5.0 ±0.11a 4.70 ±0.21a TUNEL 3.72 ±0.52 34.52 ±1.33a 16.53 ±1.19ab Caspase-3 5.23 ±0.36 20.22 ±0.30a 15.25 ±0.45ab NF-κB 6.06 ±0.40 27.63 ±0.48a 18.06 ±0.71ab

NF-κB在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，調(diào)控著一系列與凋亡有關(guān)的基因，在正常心肌中NF-κB 和 NF-κB 抑制蛋白(IκB)相結(jié)合，以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，當糖尿病時體內(nèi)血糖升高可激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致NF-κB和IκB磷酸化解離，NF-κB與靶基因增強子的κB位點特異性結(jié)合啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，有研究證實［10］，NF-κB 引起心肌細胞凋亡的靶基因包括Fas、Fas配體及p53等促凋亡基因。本實驗中DM組與CN組相比NF-κB陽性表達顯著增加，凋亡細胞增多，VAL組NF-κB陽性表達較DM組明顯降低，凋亡細胞減少，表明NF-κB與糖尿病大鼠心肌細胞凋亡有關(guān)，纈沙坦能夠抑制NF-κB的促凋亡作用，其機制可能是通過降低Fas、Fas的配體及p53的活性，從而抑制心肌細胞凋亡。

本實驗顯示糖尿病大鼠心肌細胞中存在著細胞凋亡，纈沙坦能明顯抑制糖尿病大鼠心肌細胞凋亡，下調(diào)Caspase-3和NF-κB的表達，但沒有影響血糖、血脂及胰島素抵抗情況，推測纈沙坦可能通過阻斷血管緊張素Ⅱ的作用，降低Fas的活性，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Caspase-3和NF-κB表達抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮對心肌的保護作用，但是由于實驗組大鼠血糖血脂都未得到控制，血糖與血脂是否與心肌細胞凋亡有關(guān)有待于進一步研究。

［1］ Thrainsdottir IS，Aspelund T，Thorgeirsson G，et al.The association between glucose abnormalities and heart failure in the populationbased Reykjavik study［J］.Diabetes Care，2005，28(3):612-616.

［2］ Okoshi K，Guimaraes JF，Di Muzio BP，et al.Diabetic cardiomyopathy［J］.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51(2):160-167.

［3］ Conrad CH，Brooks WW，Hayes JA，et al.Myocardial fibrosis and stiffness-with hypertrophy and heart failure in the spontaneously hypertensive rat［J］.Circulation，1995，91(1):161-170.

［4］司小晨，尚文斌，卞慧敏，等.鏈脲佐菌素加高脂膳食誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型［J］.安徽中醫(yī)臨床雜志，2003，15(5):383-385.

［5］ Yue TL，Bao W，Gu JL，et al.Rosiglitazone treatment in Zucker diabetic Fatty rats is associated with ameliorated cardiac insulin resistance and protection from ischemia/reperfusion-induced myocardial injury［J］.Diabetes，2005，54(2):554-562.

［6］ Martin DA，Siegel RM，Zheng L，et al.Membrane oligomerizationand cleavage activates the caspase-8(FLICE/MACHα1)deathsignal［J］.J Biol Chem，1998，273(8):4345-4349.

［7］ Perera L，Waldmann TA.Activation of human monocytes induces differential resistance to apoptosis with rapid down regulation of caspase-8/FLICE［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(24):14308-14313.

［8］ Condorelli G，Roncarati R，Ross J，et al.Hearttargeted overexpression of caspase-3 in mice increases infarct size and depresses cardiac function［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(17):9977-9982.

［9］ Carlsson PO，Palm F，Andersson A，et al.Chronically decreased oxygen tension in rat pancreatic islets transplanted under the kidney capsule［J］.Transplantation，2000，69(5):761-766.

［10］ Kimura K，Asami K，Yamamoto M.Structure of the promoter for the rat Fas antigen gene［J］.Bochim Biophys Acta，1997，1352(3):238-242.