時(shí)代音 胡春婷 何 婭 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院干部病房(西安 710004)

酒精已是繼病毒性肝炎之后導(dǎo)致肝損傷的第二大原因。酒精性肝纖維化導(dǎo)致肝硬化速度更快,發(fā)病率高,只要在肝纖維化階段而非延誤至中晚期肝硬變進(jìn)行合理治療,完全可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程,進(jìn)而緩解乃至治愈肝纖維化的目的。本研究以大鼠為對(duì)象,觀察黃芪湯對(duì)酒精性肝纖維化大鼠血清及肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子的影響,旨在揭示酒精性肝纖維化發(fā)病機(jī)制,并為中藥黃芪湯治療肝纖維化提供依據(jù)。

1 材 料 1.1 藥品:黃芪湯由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中藥房提供,黃芪湯由黃芪 30g,丹參 15g,白術(shù)、茯苓 12g,葛根 10g,甘草 6g組成。上述藥材加蒸餾水常規(guī)煎煮去渣,濃縮成每毫升含生藥 2g,4℃保存。大鼠用藥劑量為成人 5倍。

1.2 動(dòng)物:健康 6周齡大鼠,體質(zhì)量 200±10g。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二醫(yī)院動(dòng)物中心提供。

1.3 試劑與儀器:腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(TGF-β1)試劑盒,由武漢博士德生物工程有限公司提供。放射免疫計(jì)數(shù)器由上海核輻光電儀器有限公司提供。電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)由寧波新芝科器研究所提供。

2 方 法 2.1 動(dòng)物分組:大鼠在室溫 22±1℃,濕度50± 5%的實(shí)驗(yàn)室用平衡飼料喂養(yǎng) 1周后隨機(jī)分為 3組:酒精性肝纖維化模型(下稱(chēng)模型組,n=15);酒精性肝纖維化模型加黃芪湯干預(yù)組(下稱(chēng)治療組 n=15);正常對(duì)照組 (n=15)。

2.2 劑量選擇與受試物給予方式:從造模開(kāi)始,黃芪湯按3g/Kg給大鼠灌胃。同時(shí)對(duì)照組給予等體積生理鹽水。

2.3 動(dòng)物處理:大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后,根據(jù)文獻(xiàn)制備大鼠酒精肝纖維化動(dòng)物模型,除正常對(duì)照組外,其它各組動(dòng)物給予 400mL/L乙醇溶液 8g/kg? d,分 3次灌胃至 4周末。第 5周開(kāi)始,將乙醇濃度增至 500mL/L,9g/kg? d,分 3次灌胃至第 8周末。第 9周開(kāi)始 ,500mL/L,10g/kg? d,分 3次灌胃至第12周末。正常對(duì)照組給予生理鹽水 10mL/kg,日 1次灌胃 ,模型組:500mL/L乙醇 10g/kg.d分 2次灌胃,至第 16周末,末次給藥后禁食 12h,大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,分離血清待測(cè)。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。肝組織勻漿的制備及保存:采血后每鼠在肝右葉取約 0.5g肝組織,在低溫條件下剪碎,放入勻漿器中,再加入 9倍體積的冷生理鹽水。研成勻漿后,倒入離心管中,低溫低速離心機(jī) 3000r/min離心 30min。取上清液待測(cè)。組織學(xué)標(biāo)本的制備:取肝左葉,用甲醛固定 ,石蠟包埋,切片。

2.4 血清和肝組織檢測(cè) TN F-α、TGF-β1用放射免疫法。

2.5 病理組織學(xué)檢查一部分肝組織固定于多聚甲醛溶液中,做 HE染色,按照 2000年 9月西安會(huì)議制定的《病毒性肝炎防治方案》進(jìn)行纖維化程度分期:0期,無(wú)纖維化;S1,匯管區(qū)擴(kuò)大,輕度纖維化;S2,匯管區(qū)周?chē)w維化,纖維隔形成,小葉結(jié)構(gòu)保留;S3,纖維隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂,無(wú)肝硬化;S4,早期肝硬化。采用雙盲法制片,對(duì)記分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié) 果 在 16周的大鼠喂養(yǎng)過(guò)程中,正常對(duì)照組大鼠全部存活,模型組和治療組各死去 8只。各組血清和肝臟勻漿(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF-β1)見(jiàn)表 1、表 2。

表1 各組大鼠血清及肝組織 TNF-α變化 (ng/mlx±s)

表1 各組大鼠血清及肝組織 TNF-α變化 (ng/mlx±s)

△治療組和模型組與正常對(duì)照組相比較 P＜0.01,▲模型組與治療組比較 P＜0.01

組 別 血清 肝組織正常對(duì)照組模型組治療組18.96±1.56 33.28± 2.12△26.76± 1.23▲94.62±14.4 146.63± 22.8△113.79± 12.65▲

表2 各組大鼠血清及肝組織 TGF-β1變化 (mg/Lx±s)

表2 各組大鼠血清及肝組織 TGF-β1變化 (mg/Lx±s)

治療組和模型組與正常對(duì)照組相比較 P＜0.01,▲模型組與治療組比較 P＜0.01

組 別 血清 肝組織正常對(duì)照組模型組治療組103.69±31.26 256.23± 21.32△218.93± 28.06▲423.96±68.72 735.19± 164.14△620.51± 89.96▲

表3 各組肝纖維化分級(jí)及半定量計(jì)分

討 論 酒精性肝纖維化在發(fā)病機(jī)制上也有許多學(xué)說(shuō)。酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在肝臟炎癥中發(fā)揮著重要作用,從本研究可以看出,酒精性肝纖維化大鼠血漿和肝臟中腫瘤壞死因子(TNF-a、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF β1)明顯升高。Kupffer細(xì)胞(肝巨噬細(xì)胞)是酒精性肝纖維化產(chǎn)生的主要細(xì)胞,它的激活是肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷的重要機(jī)制之一。酒精不能直接激活Kupffer細(xì)胞,但可以通過(guò)嗜酒者腸道內(nèi)細(xì)菌的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)來(lái)激活。LPS同血液中結(jié)合蛋白(LBP)形成復(fù)合物,與效應(yīng)細(xì)胞-庫(kù)弗細(xì)胞表面的受體 CDl4相結(jié)合 ,在識(shí)別受體 T LR4的參與下進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),經(jīng)胞內(nèi)一系列相關(guān)信號(hào)分子的參與最終使核轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核,啟動(dòng)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致肝臟炎癥損傷。炎癥介質(zhì)可以引起肝細(xì)胞進(jìn)一步壞死、凋亡、炎癥和肝纖維化形成。

中醫(yī)學(xué)雖無(wú)酒精性肝纖維化之稱(chēng),但散在論述于“傷酒”、“脅痛”、“酒癖”、“酒鼓”、“黃疸”等病證之中,有其獨(dú)特的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為慢性肝病發(fā)展至肝纖維化,進(jìn)而出現(xiàn)門(mén)脈高壓、硬化的過(guò)程,是一個(gè)由絡(luò)傷氣滯,進(jìn)而發(fā)展至痰濕阻絡(luò)。正所謂“初病氣結(jié)在經(jīng),久病絡(luò)傷入血”。病邪留滯、氣血失調(diào)、臟腑受損三者相互影響,互為因果,構(gòu)成慢性肝病的整體病理基礎(chǔ)。肝藏血 ,主疏泄,體陰而用陽(yáng),脾主運(yùn)化,為后天之本,生化之源。肝脾正常保證了機(jī)體氣機(jī)升降,氣血生成、輸布及局部的結(jié)構(gòu)濡養(yǎng);病理時(shí)機(jī)體失養(yǎng) ,氣郁血結(jié) ,脾運(yùn)失健,生化乏源,促使肝病不斷進(jìn)展。中藥黃芪湯以“補(bǔ)氣健脾、活血化瘀”為主,治療酒精性大鼠肝纖維化 16周,與對(duì)照組相比較有顯著差別。同時(shí)中藥黃芪為君藥,主要體現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)酒精性肝病的認(rèn)識(shí)。黃芪中含有微量元素硒,硒能提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性,激活解毒酶系,從而對(duì)肝細(xì)胞起保護(hù)作用。黃芪可保護(hù)肝臟粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并使粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增加 ,抑制核糖核酸酶活性,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。并能保護(hù)肝細(xì)胞膜,降低血清轉(zhuǎn)氨酶.臣藥丹參具有改善抗肝細(xì)胞損傷、免疫調(diào)節(jié)的作用;丹參酚酸 B可抑制星狀細(xì)胞增殖及 I型膠原分泌與總膠原的沉積、抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的生成。茯苓、白術(shù)有免疫調(diào)節(jié)作用;佐葛根是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中最具代表性的解酒藥物。使藥甘草調(diào)和諸藥。

總之,黃芪湯對(duì)大鼠酒精性肝纖維化有保護(hù)作用。

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