黃桂鋒，盧健敏，熊大經(jīng)，謝 慧

(1.泉州市中醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建 泉州 362000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

變態(tài)反應(yīng)性鼻炎是耳鼻咽喉科常見病，也是常見的呼吸道變應(yīng)性疾病，并且上下呼吸道炎癥具有密切的一致性和相關(guān)性。本病已成為一個(gè)全球性的健康問題[1]。變應(yīng)性鼻炎屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”“鼽嚏”的范疇。眾多醫(yī)家認(rèn)為鼻鼽的發(fā)生，由內(nèi)外病因相應(yīng)而致。外由風(fēng)寒濕熱，內(nèi)因肺脾腎虛，其中又以肺脾失調(diào)、脾氣虧虛為主。本實(shí)驗(yàn)從脾虛型AR入手，采用RT-PCR方法，從基因水平上研究中藥復(fù)方對實(shí)驗(yàn)性AR大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA表達(dá)及嗜酸性粒細(xì)胞的影響，探討中藥復(fù)方對脾虛型AR的影響及對該型AR的治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠70只，SPF級(jí)，3月齡，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：scxk(川)2006-18，飼養(yǎng)于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度控制在20～25 ℃。

1.2 藥物與試劑 中藥復(fù)方由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。氯雷他啶，卵白蛋白：美國Sigma公司生產(chǎn)。TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑，寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)。PCR引物，寶生物工程(大連)有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組方法 70只大鼠，自由喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分為7組。每組10只。即空白組、脾氣虛AR模型組、脾氣虛AR中藥組、脾氣虛AR西藥組、AR模型組、AR中藥組、AR西藥組。

脾氣虛模型:采用飲食不節(jié)加游泳疲勞過度綜合因素傷脾的方法[2]。飲食不節(jié)：病證結(jié)合組動(dòng)物單日喂飼甘蘭每只10～15 g，自由飲水;雙日豬脂2 mL/只灌胃，自由進(jìn)食，飲水，共8 d。過勞傷氣：病證結(jié)合組動(dòng)物在上述處理的當(dāng)日放入20 ℃水池中游泳至疲勞過度(以驅(qū)趕無力游泳或欲溺水為指征)，每日1次，共8 d。

變應(yīng)性鼻炎模型：按照安云芳等[3]報(bào)道的方法造模。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物以卵白蛋白0.30 mg作抗原，氫氧化鋁粉末30 mg作佐劑，加生理鹽水至l mL形成混懸液，腹腔內(nèi)注射，隔日1次，共7次。腹腔注射免疫完成后，每側(cè)鼻腔均以5%卵白蛋白的生理鹽水溶液20 μL局部免疫，每日1次，共7次?？瞻捉M動(dòng)物用等量生理鹽水代替進(jìn)行腹腔注射和鼻腔滴注，方法同上。

藥物干預(yù)：空白組、脾氣虛AR組、AR組用等量的生理鹽水灌胃，其余各組在局部激發(fā)的同時(shí)，每日分別予以相應(yīng)的藥物干預(yù),給藥1 h后再予以5%的卵白蛋白溶液局部半量激發(fā)，即5%的卵白蛋白溶液20 μL，每側(cè)10 μL滴入大鼠雙側(cè)前鼻孔。

2.2 給藥方法 造模結(jié)束后，即第22天后開始給藥，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算方法計(jì)算出用藥劑量[4]。每日以成人臨床劑量8倍的中藥(中藥組)及西藥(西藥組)灌胃，給藥時(shí)間為7 d?？瞻捉M、AR模型組、脾虛AR模型組:正常喂養(yǎng)，并用相同量的生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.3.1 鼻黏膜Eotaxin-mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,在超凈工作臺(tái)上取鼻黏膜用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法,進(jìn)行Eotaxin-mRNA(信使RNA)水平表達(dá)的檢測。具體方法:從美國國立衛(wèi)生院所維護(hù)的國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得最新版本的SD大鼠Eotaxin和內(nèi)參基因β-actin的mRNA序列。利用引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)其引物。然后委托大連寶生物工程有限公司完成引物合成。Eotaxin-mRNA引物:5’-AAACCATAAACAACCTCCTC-3’，3’-ATTGACTCCTACTATCCTCCTG-5’，采用美國TriZol試劑(Cat NO: 15596-018)一步法提取總RNA→反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)→PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果通過凝膠電泳分析系統(tǒng)檢測。由于反應(yīng)眾多，為保障不同反應(yīng)之間的可比性，采用不同反應(yīng)產(chǎn)物帶的相對熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行橫向比較，確定不同基因在不同樣本的相對表達(dá)程度。

2.3.2 鼻中隔黏膜嗜酸細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù) 于末次鼻腔激發(fā)后30 min，將大鼠斷頭處死，并將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線剪開鼻腔，暴露鼻中隔，剝離雙側(cè)鼻中隔黏膜并按組及時(shí)固定于10%中性福爾馬林液內(nèi),常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡進(jìn)行EOS計(jì)數(shù)。在高倍視野(40×10倍)下隨意選取鼻中隔黏膜的10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每高倍視野下EOS的均數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 用藥后大鼠鼻黏模嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見表1。

表1 用藥后各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s,n=10)

3.2 用藥后大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 用藥后各組大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA相對表達(dá)量比較(±s,n=10)

4 討論

熊大經(jīng)教授認(rèn)為，脾虛為鼻鼽的主要病機(jī)。臨床上單純的肺氣虛寒型鼻鼽并不多見，既使是肺氣虛寒型鼻鼽，治療時(shí)如果單純從肺論治，不同時(shí)兼補(bǔ)脾氣，療效并不理想。因?yàn)槠⒎螢槟缸酉嗌年P(guān)系，不論是“母病及子”還是“子盜母氣”，均可按虛則補(bǔ)其母的原則，以培土生金法治之。故治療應(yīng)從健脾入手，健脾益氣，培補(bǔ)中土，達(dá)到培土生金、益氣固表之目的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)[5]認(rèn)為本病與遺傳密切相關(guān)，帶有與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病相關(guān)基因的個(gè)體稱為特應(yīng)型個(gè)體，并且本病的發(fā)生與宿主的免疫紊亂有關(guān)。從而確立了本病的治療關(guān)鍵在于恢復(fù)機(jī)體的正常免疫機(jī)能狀態(tài)，改善特應(yīng)型體質(zhì)。因此，選用黃芪、白術(shù)等補(bǔ)中益氣、健脾除濕；僵蠶等通竅通絡(luò)止癢；五味子等益腎止涕?？v觀全方，通過補(bǔ)中益氣、培土生金，達(dá)到消除癥狀、改善體質(zhì)的目的。

嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)的浸潤是變應(yīng)性鼻炎炎癥反應(yīng)的基本病理改變[6]。AR的發(fā)病過程可分為2個(gè)階段:速發(fā)相反應(yīng)和遲發(fā)相反應(yīng)。40%～50%的AR患者在速發(fā)相反應(yīng)消退后，又會(huì)重新出現(xiàn)以鼻塞、鼻漏、噴嚏為主的復(fù)發(fā)現(xiàn)象，這就是遲發(fā)相反應(yīng)。在鼻部的表現(xiàn)以呼吸道阻力增加為主，與速發(fā)相反應(yīng)相比它的持續(xù)時(shí)間更長,治療效果差。是以EOS、嗜堿性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在鼻黏膜內(nèi)大量浸潤為特征。比較而言，EOS在此期間作用最為重要,有研究[7]表明它釋放的白三烯所致的鼻塞效應(yīng)比組胺更為突出。而且有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8]EOS還可能是一些細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-5、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的重要來源。同時(shí)EOS又可通過自分泌Eotaxin、RANTES等趨化因子,正反饋促使Th2細(xì)胞在炎癥局部的聚集、刺激特異性T細(xì)胞克隆的活化與增生、促進(jìn)EOS的募集、加重EOS炎癥反應(yīng)，從而使炎癥進(jìn)一步放大。由此可見,EOS不僅是變應(yīng)性疾病的主要效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)它還在變態(tài)反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大過程中起著重要的作用。這提示阻斷EOS的作用會(huì)緩解變應(yīng)性疾病的發(fā)生。監(jiān)測EOS水平對判斷AR的嚴(yán)重程度及防治均有積極的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:中藥復(fù)方可明顯降低AR大鼠鼻黏膜組織中的EOS計(jì)數(shù)，該藥理作用與西藥氯雷他啶相似。表明中藥具有抑制EOS在大鼠鼻黏膜浸潤的免疫藥理作用,這可能是該藥治療AR的一個(gè)作用機(jī)制。

嗜酸性細(xì)胞特異性趨化因子(Eotaxin)，主要細(xì)胞來源為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和活化的白細(xì)胞[9]。Eotaxin的靶細(xì)胞主要是EOS，Eotaxin是一種強(qiáng)有力的EOS激活劑,對于EOS具有很強(qiáng)的優(yōu)先選擇性，特異性趨化EOS并促使EOS的局部浸潤并激活，Eotaxin對淋巴細(xì)胞中的Th2亞群也有趨化作用，并促進(jìn)其分泌T細(xì)胞淋巴因子如IL-3、IL-4、IL-5和GM-csF等。因此，國外有關(guān)專家推測:Eotaxin通過對Eos、嗜堿粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞的共同調(diào)節(jié)，從而引發(fā)過敏性炎癥反應(yīng)。Bouchaib等[10]研究發(fā)現(xiàn)Eotaxin不僅可以趨化和激活EOS，而且可以通過Eotaxin-CCR3途徑在IL-5的協(xié)同作用下促進(jìn)CD34+干細(xì)胞向EOS分化。此外，除EOS高表達(dá)Eotaxin的專一性受體CCR3外,嗜堿粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、Th2細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞也表達(dá)CCR3并具有功能性作用,因此Eotaxin除作用于EOS外也通過CCR3作用于表達(dá)CCR3的其它細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的作用[11-13]。我們知道這些細(xì)胞也是參與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的重要細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜Eotaxin-mRNA的表達(dá)明顯高于正常對照組(P<0.01)。用藥后各治療組Eotanxin mRNA表達(dá)明顯減弱(P>0.05)。提示中藥可能通過干預(yù)Eotanxin mRNA表達(dá)，抑制EOS的浸潤，活化和脫顆粒，從而達(dá)到治療變應(yīng)性鼻炎的作用。

[1]Savage J,Roy D.Allergic rhinitis:an update[J].R Soc Health,2005,125:172-175.

[2]李德新.脾虛證對生物膜結(jié)構(gòu)與功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,1993,20(6):39.

[3]安云芳,趙長青,朱慶義,等.變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜P物質(zhì)受體的研究[J].中華耳鼻咽喉科雜志,1998,33(3):139-141.

[4]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:334-335.

[5]劉永祥.淺談中醫(yī)免疫學(xué)[J].中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,1999,7(1):51-52.

[6]鄭東淑,張秋貴.變應(yīng)性鼻炎與支氣管哮喘的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)文摘(耳鼻咽喉科學(xué)),2004,19(2):65.

[7]郭明麗,聶貴紅.嗜酸性粒細(xì)胞和變態(tài)反應(yīng)[J].河北醫(yī)藥,2002,24(10):827-828.

[8]BandeiraZMeloC,HerbstA,WellerPF.Eotaxins.Contributing to The diversity of eosinophil recruitmentand activation[J].AmJ Respir Cell MolBiol,2001,24(6):653-657.

[9]PonathPD,Qin SX,RinglerD J,et al.Cloning of the human eosinophil chemoattractant,eotaxin[J].Clin Invest,1996.97:604.

[10]Bouchaib Lamkhioued,Soussi Gounni Abdelilah,Qutayba Hamid,et al.TheCCR3 Receptor Is Involved in Eosinophil Differentiation and Is Up-Regulated by Th2 Cytokines in CD34+ Progenitor Cells[J].Immunol,2002,169:537-547.

[11]Franz-Bacon K,Dairaghi DJ,Boehme SA,et al.Human thymocytes express CCR-3 and are activated by Eotaxin[J].Blood 1999,93:3233-3240.

[12]Sylvie Beaulieu,Davide F Robbiani et a1.Expression of a Functional Eotaxin(CC Chemokine Ligand 11) Receptor CCR3 by Human Dendritic Ce11s[J].The Journal of Immunology,2002,169:2925-2936.

[13]劉中娟,林嘉友,宋耀虹.Eotaxin及其受體與支氣管哮喘[J].中華醫(yī)學(xué)全科雜志,2003,2(12):55-57.