王 瑩,李文媛,李明秋,丁 利,管業(yè)秋,趙斯達

(牡丹江醫(yī)學院解剖教研室,黑龍江牡丹江157011)

腦缺血后恢復(fù)腦血流是治療腦缺血最關(guān)鍵的方法,但再灌注后可加重缺血腦組織的損傷,這種損傷以凋亡為主,因此減少缺血/再灌注后神經(jīng)元凋亡為重要的腦保護機制。細胞凋亡線粒體通路中重要酶Caspase-9和Caspase-3在線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡中起著重要的作用[1]。通過干預(yù)線粒體通路,可阻斷細胞凋亡的進程。Livin作為一種新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)能夠干預(yù)線粒體通路,發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[2]。但對于Livin、Caspase-9和Caspase-3在腦缺血再灌注損傷中的作用研究較少。黃芪皂甙Ⅳ是一種純化小分子皂甙(分子量784),作為黃芪的主要活性成分,已被廣泛的應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療[3],能夠促進腦缺血損傷的神經(jīng)功能恢復(fù)。但關(guān)于黃芪皂甙Ⅳ在腦缺血中抑制細胞凋亡的機制研究尚不明確。本研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)模型,觀察黃芪皂甙Ⅳ對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡及Livin、caspase-9、caspase-3表達的影響,探討黃芪皂甙Ⅳ抑制細胞凋亡的作用機制,為黃芪皂甙Ⅳ臨床治療腦缺血再灌注損傷提供新的實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠42只,清潔級,體質(zhì)量280～320 g,購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號:SYXK[遼]2003-0013)。

1.2 試劑與藥物 黃芪皂甙Ⅳ(西安賽邦醫(yī)藥),純度98%。用時以生理鹽水配成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL。尼莫地平注射液(河北醫(yī)科大學制藥廠),20 mg/100 mL,用時以生理鹽水配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。Livin、Caspase-9和Caspase-3多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒、TUNEL試劑盒購于北京中山生物試劑公司;TRI-zol試劑、SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs購自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、DL 2000 DNA標志物購自Takara公司;Livin、Caspase-9、Caspase-3和β-actin引物由大連寶生物合成。

1.3 動物模型制備與分組 大鼠按體質(zhì)量分層,隨機分為4組:假手術(shù)組(n=6)、模型組(n=12)、尼莫地平對照組(n=12)、黃芪皂甙Ⅳ組(n=12)。參照宮健偉等[5]的線栓改良法復(fù)制大鼠左側(cè)大腦MCAO腦缺血模型。各組于缺血前5 min第1次給藥,腹腔注射,缺血后12、24、48 h給藥3次,共給藥4次。黃芪皂甙Ⅳ給藥劑量為20 mg/kg,尼莫地平注射液給藥劑量為1 mg/kg,均為臨床等效劑量。假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。術(shù)后當日給大鼠飲水,次日開始自由飲食。

1.4 神經(jīng)功能評估 采用Chen等[6]報道的神經(jīng)功能損害評分表(neurological severity scores,NSS),從運動、感覺、反射、平衡4方面進行神經(jīng)功能損害評估,22分為最嚴重的神經(jīng)功能損害,即評分越高神經(jīng)功能損害越嚴重。缺血后3 d各組大鼠分別進行NSS評分。

1.5 免疫組織化學檢測 缺血后3 d,取腦組織行冰凍切片,在視交叉后1～4 mm處冠狀切面切開,在海馬齒狀平面連續(xù)冠狀切片,片厚4 μ m。組織薄片以PBS漂洗2次,0.5%過氧化氫孵育10 min;PBS漂洗3次,正常山羊血清37℃孵育15 min后,滴加稀釋后的一抗Livin(1∶100)、Caspase-3(1∶150),Caspase-9(1∶150),4℃過夜。滴加生物素標記體,30 min,37℃。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37℃,30 min。DAB顯色液顯色。蘇木精復(fù)染,以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析:每個標本取4張切片,400倍光鏡下每張切片在海馬隨機選5個視野,用計算機圖像分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)對各組陽性細胞進行IOD值分析。

1.6 凋亡神經(jīng)元的檢測 采用原位末端TUNEL標記法檢測。將甲醛固定大鼠海馬組織標本常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,厚4 μ m,脫蠟后按照In situ-Apoptosis Detection Kit說明書操作;陰性對照采用pH 7.2～7.6,0.01 mol/L PBS代替TUNEL反應(yīng)液。陽性率的定量分析:每個標本取4張切片,每張切片在海馬隨機選5個視野,400倍光鏡下應(yīng)用目鏡陽性細胞所占的百分比。細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)=凋亡陽性細胞總數(shù)/細胞總數(shù)。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

1.7.1 總RNA提取 每組取6只在水合氯醛麻醉下,經(jīng)心臟灌流焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的生理鹽水,以沖凈血液。取大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)腦組織50mg,置于液氮中冷凍,采用Trizol法提取總RNA。進行RNA純度鑒定。

1.7.2 采用嵌合熒光檢測法 以O(shè)LIGO六聚體為逆轉(zhuǎn)錄引物,以提取的總RNA為模板,在AMV催化下反轉(zhuǎn)錄出cDNA。根據(jù)TAKARA Real time PCR試劑盒與擴增儀說明,采用50 μ L反應(yīng)體系:引物設(shè)計及合成按照已報道的序列設(shè)計并合成Livin、Caspase-3、Caspase-9以及內(nèi)參照β肌動蛋白β-actin的特異性引物。各引物的序列為:Livin:上游5'-CTGGGACCCGTGGGAAGAAC-3',下游5'-TCCTGGGCACTTTCAGAC TG-3',169bp。Caspase-3:上游5'-AATTCAAGGGACGGG TCATG-3',下游5'-GCTTGTGCGCGTACAGTTTC-3',100 bp。Caspase-9:上游5'-CCAGATGCTGTCCCAT ACC-3',下游5'-ATTGGCGACCCTGAGAAG-3',228bp。β-actin:上游5'-TGGTGGGT ATGGGTCAGAAGGACTC-3',下游5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3',265 bp。總反應(yīng)體系包括cDNA 4 μ L,1 mmol/LdNTPs 10 μ L,10 xTaq聚合酶buffer 5 μ L,上下游引物各2 μ L(10 pmol/L),Mg2+3 μ L,去離子水18 μ L,TaqTM 25 μ L,放入Light Cycler定量PCR反應(yīng)儀,反應(yīng)條件:變性94℃30 s,退火54℃45 s,延伸72℃45 s,反應(yīng)循環(huán)數(shù)為45,依據(jù)標準定量曲線對PCR產(chǎn)物定量分析。

1.7.3 每個標本擴增Livin、Caspase-3、Caspase-9基因同時都擴增β-actin為對照,每次擴增均設(shè)置pGEM-TCaspase3,pGEM-T-Caspase9,pGEM-T-β-actin,pGEM-TLivin質(zhì)粒標準曲線;記錄標本CT值,首先以各組標準曲線CT值,回歸出各自的回歸方程(Livin、Caspase-3,Caspase-9,β-actin),再由回歸方程計算出各標本的目的基因表達量,計算出Livin、Caspase-3、Caspase-9和β-actin的平均CT值以及△CT值,通過2ΔΔCt方法進行相對定量。

1.8 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行分析,連續(xù)型變量采用均值±標準差(±s)表示,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析,2組間均數(shù)比較方差齊時用LSD法,方差不齊時用Games-Howell法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組神經(jīng)功能損害評分值為0,無神經(jīng)功能損害。黃芪皂甙Ⅳ組(8.21±0.89)分,其神經(jīng)功能損害評分低于模型組(10.06±0.96)分和尼莫地平組(11.06±0.96)分,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 免疫組織化學染色和TUNEL染色 Livin、Caspase-3、Caspase-9陽性細胞胞質(zhì)著色,呈棕黃色或棕褐色。假手術(shù)組海馬中未見Caspase-3、Caspase-9蛋白表達,Livin蛋白有少量表達。模型組Livin蛋白也表達很少,與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但Caspase-9和Caspase-3蛋白表達較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.05)。與模型組和尼莫地平對照組比較,黃芪皂甙Ⅳ組Livin蛋白表達顯著增高(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3蛋白表達顯著下降(P＜0.05)。假手術(shù)組腦組織未見細胞凋亡。模型組、尼莫地平對照組、黃芪皂甙Ⅳ組均可見到海馬區(qū)細胞凋亡,凋亡細胞胞質(zhì)呈棕褐色,黃芪皂甙Ⅳ組凋亡指數(shù)明顯少于模型組和尼莫地平組,差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表1。

2.3 實時熒光定量RT-PCR的擴增效率檢測 假手術(shù)組海馬區(qū)中未見Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達,Livin mRNA表達較少,模型組Livin mRNA表達較假手術(shù)組無統(tǒng)計學意義,但Caspase-9和Caspase-3 mRNA表達較假手術(shù)組比較(P＜0.05)。與模型組和尼莫地平對照組比較,黃芪皂甙Ⅳ組Livin mRNA表達顯著增高(P＜0.05),Caspase-9和Caspase-3 mRNA表達顯著下降(P＜0.05),見表2。

3 討論

腦缺血性損傷的機制和防治一直是該領(lǐng)域研究的熱點[7],海馬神經(jīng)元對缺血具有選擇性敏感,短暫性腦缺血即可導(dǎo)致該區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡(DND),所以海馬成為缺血性腦損傷研究的一個典型腦區(qū)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)短暫腦缺血后海馬出現(xiàn)DND與細胞凋亡密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn),腦缺血神經(jīng)元凋亡受多種基因調(diào)控。天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族(Caspase)是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶,迄今為止這一家族至少有14個成員,其中Caspase-9、Caspase-3是細胞凋亡線粒體通路中最重要的蛋白酶。線粒體通路是指氧自由基、鈣超載等凋亡刺激因素使線粒體通透性增加,線粒體跨膜電位下降,釋放細胞色素C(CytoC),CytoC主要激活Caspase-9進而也激活下游的Caspase-3,誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。而Livin作為一個新的凋亡抑制蛋白能夠作用于線粒體途徑,可以直接與Caspase-9前體蛋白(proCaspase-9)和其激活形式結(jié)合從而抑制其活性,還可以直接結(jié)合并抑制Caspase-3的活性,阻斷他們依次裂解激活,同時阻斷了Caspase-3對proCaspase-9的反饋激活,抑制細胞的調(diào)亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠腦組織未見細胞凋亡、Caspase-9和Caspase-3的表達,Livin表達很少。模型組可見到海馬神經(jīng)元細胞凋亡,Caspase-9、Caspase-3顯著表達(P＜0.05),且與凋亡分布一致。但模型組Livin表達較少,我們推測可能與腦缺血損傷后Caspase-9和Caspase-3表達增強并與之結(jié)合有關(guān)。

表1 海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)及Livin、Caspase-9、Caspase-3蛋白平均光密度值(OD)比較(±s,n=6)

表1 海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)及Livin、Caspase-9、Caspase-3蛋白平均光密度值(OD)比較(±s,n=6)

注:與假手術(shù)組比較,##P＜0.01;與模型組比較,△P＜0.05。

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表2 海馬區(qū)Livin、Caspase-9、Caspase-3 mR NA相對表達(2-Δ ΔCt值)比較(±s,n=6)

表2 海馬區(qū)Livin、Caspase-9、Caspase-3 mR NA相對表達(2-Δ ΔCt值)比較(±s,n=6)

注:與假手術(shù)組比較,##P＜0.01;與模型組比較,△P＜0.05。

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本實驗中,黃芪皂甙Ⅳ組的神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于尼莫地平對照組和模型組,提示黃芪皂甙Ⅳ具有神經(jīng)保護作用,這為黃芪皂甙Ⅳ治療缺血性腦損傷提供了行為學上的實驗依據(jù)。盡管黃芪皂甙Ⅳ在腦缺血損傷條件下能夠發(fā)揮多種作用,但其在腦缺血再灌注后對細胞凋亡的作用機制仍不明確。本實驗結(jié)果表明,與尼莫地平對照組和模型組相比較,黃芪皂甙Ⅳ能明顯上調(diào)Livin表達,下調(diào)Caspase-9和Caspase-3表達,降低神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)。但Caspase-9、Caspase-3表達下調(diào)是由于黃芪皂甙Ⅳ直接抑制Caspase-3和Caspase-9表達,還是因黃芪皂甙Ⅳ上調(diào)Livin從而抑制Caspase-9、Caspase-3活性所致,仍有待進一步研究。

綜上所述,黃芪皂甙Ⅳ可能通過上調(diào)海馬區(qū)Livin表達,下調(diào)Caspase-9和Caspase-3表達,抑制細胞凋亡線粒體途徑,來減少腦缺血后神經(jīng)元凋亡,對腦缺血損傷發(fā)揮保護作用。

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